微生物发酵法制备牛樟叶粗多糖研究*

张 蓓，余潇苓，万永艳，张洪平，梁学政△

（1. 广西壮族自治区柳州市中医医院，广西 柳州 545026； 2. 浙江中医药大学附属第一医院，浙江 杭州 310000）

牛樟Cinnamomum kanehirae Hayata 是樟科樟属植物，为我国台湾特有，牛樟芝寄生于其腐朽内壁。牛樟芝在台湾民间被称为“森林中的红宝石”，是珍贵药用真菌，具有极高的研究和商业价值，价格昂贵，但始终不能形成产业化发展［1－2］。牛樟叶水提物的成分研究结果表明，多糖成分含量极高，药效学试验表明，其酒精性肝损伤保护作用及抗衰老作用明显；传统的提取多糖的方法包括水提取、碱提取、酸提取、苯酚提取、微波辅助提取、超声辅助提取、酶提取等，但多糖提取率低，纯度不高，原料浪费严重，且影响多糖的结构分析和功效鉴定［3－6］。用微生物法提取多糖，是利用微生物在生长过程中会利用其他营养物质但不利用多糖进行生长的特点，提取时对植物多糖进行去杂纯化，反应条件温和，且能耗少，提取率高［7－8］。本研究中以期通过研究成果，为牛樟产业化发展提供参考，同时为发酵法制备中药材有效成分的可行性作进一步论证。现报道如下。

1 仪器、试药与菌种

1.1 仪器

AL204／01 型电子天平（梅特勒－托利多仪器有限公司，精度为0.1 mg）；XMTD－8222 型电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；L5 型紫外分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）；KQ5200E 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率为240 W，频率为40 kHz）。

1.2 试药

牛樟叶由广西柳州市天姿园艺有限公司提供，由柳州市中医医院吴冰副主任药师鉴定为正品，标本保存于柳州市中医医院药学部标本室；苯酚（成都市科龙化工试剂厂，批号为2017091401）；硫酸（批号为2020030501），无水乙醇（批号为2020011402），均为分析纯，购于成都市科隆化学品有限公司；无水葡萄糖对照品（中国食品药品检定研究院，批号为110833－201707，规格为100 mg，含量≥99%）。

1.3 菌种

酵母菌［LWCC2012（ATCC9763）］，枯草芽孢杆菌［LWCC1005（CMCC（B）63501））］，黑 曲 霉［LWCC2002（CMCC（F）98003）］，均购于上海鲁微科技有限公司；米曲霉（上海保藏生物技术中心，编号为AS3.951）；马铃薯葡萄糖琼脂培养基（编号为1074511），马铃薯葡萄糖液体培养基（编号为1084331），均购于广东环凯微生物科技有限公司。

2 方法与结果

2.1 样品处理

种子液制备：取菌种复苏液划线进行斜面培养（PDA），酵母菌和枯草芽孢杆菌35 ℃培养3 d，黑曲霉和米曲霉25 ℃培养5 d。各取1 环接种至50 mL 进行液态培养（PDB），酵母菌和枯草芽孢杆菌35 ℃培养3 d，黑曲霉和米曲霉25 ℃培养5 d，得种子液。

样品发酵：牛樟叶打粉，过60 目筛，取1 g，加10 mL水（以刚好浸润药粉为度）润湿，灭菌，接菌量6%，发酵1 ～8 d。

样品提取：发酵后，加水40mL，90℃水浴浸渍76 min，抽滤，取滤液10 mL，加无水乙醇使含醇量达90%，静置过夜，抽滤，得粗多糖，加水溶解定容至250 mL。

2.2 溶液制备

对照品溶液：取无水葡萄糖对照品0.024 8 g，精密称定，加水定容至250 mL，即得。

供试品溶液：牛樟叶打粉，过60 目筛，取1 g，加10 mL水（以刚好浸润药粉为度）润湿，灭菌，接菌量6%，发酵3 d，发酵后，加水40 mL，90 ℃水溶浸渍76 min，抽滤，取滤液10 mL，加无水乙醇使含醇量达90%，静置过夜，抽滤得粗多糖，加水溶解，定容至250 mL，即得。

2.3 牛樟叶多糖含量测定

取1.0 mL 供试品溶液，置10 mL 比色管中，加5%苯酚溶液1.0 mL，混匀，加浓硫酸3.0 mL，90 ℃水浴放置15 min，迅速冷却至室温，以水作空白对照，于490 nm波长处测定吸光度。

2.4 方法学考察

标准曲线建立：精密量取对照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，分别置10 mL 具塞比色管中，分别加水至1.0 mL，加5%苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速精密加入硫酸3 mL，摇匀，置90 ℃水浴中保温15 min，取出，迅速冷却至室温。以水作空白对照，于490 nm 波长处测定吸光度，以吸光度（X）为纵坐标、质量浓度（Y）为横坐标绘制标准曲线，得回归方程Y ＝5.962 7 X ＋0.337，R2＝0.999 2（ n ＝2）。

精密度试验：取2.2 项下对照品溶液（质量浓度为0.099 2 mg／mL），连 续 进 样6 次。结 果 的 RSD 为1.28%（n ＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密吸取供试品溶液，分别于0，2，4，6，12，24 h 时进样，测定峰面积。结果的RSD 为0.55%（n ＝6），表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

重复性试验：平行制备同一批（批号为20200204）样品6 份，依法制备供试品溶液，进样测定6 次。结果的RSD 为0.87%（n ＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取重复性试验项下样品0.5 g，精密称定，共6 份，加入适量对照品，依法制备供试品溶液，进样测定吸光度，并计算回收率。结果回收率为99.05%，RSD 为1.65%（n ＝6）。

2.5 发酵条件单因素考察

菌种和发酵时间：对酵母菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、米曲霉4 个菌种（分别编号为Ⅰ－Ⅳ）进行筛选，测定各菌种发酵的粗多糖含量。称取牛樟叶1 g，共32 份，分为4 组，每组8 份。按2.1 项下方法处理，每组接种不同菌种，接菌量均为6%，35 ℃培养，每天从4 组里取1 份；按2.1 项下方法处理，测定粗多糖含量，确定发酵菌种。结果米曲霉在发酵第3 天的粗多糖含量最高，故确定米曲霉为发酵菌种。详见表1。

发酵温度：根据菌种和发酵时间项下试验结果，选取最佳发酵菌种、发酵时间进行发酵，接菌量均为6%，分别考察25，30，35 ℃培养箱温度下，对粗多糖含量的影响，结果25 ℃发酵温度下粗多糖含量最高。详见表2。

接菌量：选取最佳发酵菌种、发酵时间、发酵温度进行发酵，考察接菌量分别为4%，6%，8%，10%，即0.4，0.6，0.8，1.0 mL 对粗多糖含量的影响，结果接菌量为6%时粗多糖含量最高。详见表3。

表1 发酵菌种对粗多糖含量的影响Tab.1 Effect of fermentation strains on the content of crude polysaccharide

表2 不同发酵温度对粗多糖含量的影响Tab.2 Effect of different fermentation temperatures on the content of crude polysaccharide

表3 不同接菌量对粗多糖含量的影响Tab.3 Effect of different inoculation amount on the content of crude polysaccharide

2.6 BBD 响应面法优化提取工艺条件

发酵工艺条件：根据单因素试验与Box－Behnken试验设计原理，以发酵时间（因素A）、发酵温度（因素B）、接菌量（因素C）为自变量，以粗多糖含量为响应值，进行Box－Behnken 试验，每组平行做3 次。因素与水平见表4。

表4 试验设计因素水平表Tab.4 Factors and levels of the experimental design

回归模型建立及方差分析：参照Box－Behnken 试验设计原理，以发酵时间（因素A）、发酵温度（因素B）、接菌量（因素C）为自变量，粗多糖含量为响应值，进行试验。试验设计与结果见表5。

表5 Box－Behnken 试验设计与结果Tab.5 The design and results of Box－Behnken test

参考文献［9］，利用Design Expert 8.0.6 软件对上表试验数据进行多元回归拟合，得牛樟叶粗多糖的含量（Y）与自变量发酵时间（A）、发酵温度（B）、接菌量（C）之 间 的 二 元 多 项 回 归 方 程 Y ＝40.67－6.06 A－4.96B ＋4.99C ＋0.89AB－4.66AC ＋0.60BC－7.57A2＋5.04 B2＋2.75 C2。回归模型及方差分析结果见表6。可知，该模型的Pr ＞F 值＝0.003 6，失拟误差不显著（Pr ＞F 值＝0.206 5 ＞0.05），表明该模型的显著性高，回归方程对试验数据的显著性高，无失拟因素存在，回归方程对试验数据的拟合度良好。对粗多糖含量的影响大小顺序为发酵时间＞接菌量＞发酵温度。

表6 回归方程及方差分析结果Tab.6 Regression equation and results of ANOVA

响应面分析：利用Design Expert 8.0.6 软件分别绘制各因素交互作用的响应面图。结果见图1。等高线越接近椭圆形或响应面线越陡峭说明这2 种交互因素对响应值的影响越显著；反之，不显著［10－11］。由图1 可知，发酵时间和接菌量的交互作用对粗多糖含量的影响最显著，发酵时间和发酵温度及发酵温度和接菌量的交互作用对粗多糖含量的影响不显著。

最优发酵工艺：通过Design－Expert 8.0.6 软件优化得到的粗多糖最佳提取条件为发酵时间2.23 d，发酵温度25 ℃，接菌量6%。

2.7 最佳提取工艺确定和验证试验

为验证响应面法所得结果的可靠性，对模型优化的工艺条件进行验证。考虑到试验的可行性与便捷性，选择工艺参数发酵时间为2.5 d，发酵温度为25 ℃，接菌量为6%，试验3 次，粗多糖平均含量为64.354 7 mg／g。结果表明，回归方程与真实试验情况拟合度较好，优化的工艺可靠、可行。

3 讨论

植物、海洋生物及菌类等来源的多糖作为有生物活性的天然产物，有抗肿瘤、免疫、抗凝血、降血糖和抗病毒活性作用。植物多糖功能独特，毒性低，作为新药发展的方向具有广阔的应用前景［12］。响应面法基于单因素试验基础上得到的点，并从这些点中获得完整、连续的面，再在面中获得最优值［13］。因此，单因素的选择是该方法可行的关键因素。本试验中单因素的选取参考了大量的发酵工艺参数。

图1 各影响因素间的交互作用对牛樟叶粗多糖含量影响的响应面图及等高线图Fig.1 Response surface diagram and contour map of the interaction of various factors on the extraction of crude polysaccharides from Cinnamomum kanehirae Leaves

本研究中采用发酵法用于提取牛樟叶粗多糖，牛樟叶未经炮制，仅作灭菌处理后用生药试验。目前，多糖的提取方法主要有煎煮提取、超微粉碎提取［14］、微波辅助提取［15］等，且从物理变化上来改变提取率，很难提高提取率，始终不是最优的提取方法。发酵法提取是在原提取方法的基础上兼用化学方法作进一步改进，操作与原方法一样，有效地提高了提取率。

发酵法多用于食品工艺，较少运用在天然药物的提取，考虑到酵母菌能有效将植物淀粉转化为糖类成分，优先用单糖类成分作进一步发酵，只要有效控制发酵时间，就能提高粗多糖的提取量。由于优先利用小分子糖类，有利于本课题下一步进行多糖类成分的富集及纯化研究。同时，经发酵法制备后的有效成分的药理学作用优于未经发酵的提取物［16－18］。前期试验证明，发酵法制备牛樟叶粗多糖得率远高于未经发酵法提取的牛樟叶粗多糖得率，但药理活性需作进一步考证。