过敏原检测的临床应用与新进展

李一仙，杨军，夏宇

过敏是一个全球性问题，随着现代工业化的进程，过敏性疾病的发生率显著增高。过敏原是其发病的主要原因，而过敏原检测是最重要的诊断依据。目前过敏原的检测手段日益增多与完善，其对于不同年龄组、各类过敏性疾病等的适宜性不同，而临床工作者对各种检测方法的选择往往存在困扰。另有原发性免疫缺陷病这类特殊患者，皮疹严重、IgE明显升高，极易与过敏性疾病混淆。故总结归纳过敏原的各种检测方法及其新进展，对查找过敏原并予以针对性防控，从而减少过敏性疾病的发作具有重要的临床意义。

过敏性疾病的发病机制包括：IgE介导的Ⅰ型变态反应、其他3型变态反应和类过敏反应。其中IgE介导的Ⅰ型变态反应是最主要的机制。传统的过敏原检测主要分为两大类，即体内检测和体外检测。体内检测主要有：皮肤试验(包括：皮肤点刺试验、皮内试验、特应性斑贴试验)、口服食物激发试验；体外检测主要有IgE依赖的荧光酶标法、免疫印迹法、酶联免疫吸附法等及非IgE依赖的嗜酸细胞阳离子蛋白检测。IgE依赖的过敏原检测是目前应用最广泛的手段，其正往更快速、更微量血样、更多检测项目、更高灵敏度和精密度的方向发展，出现了生物芯片、分子诊断等手段；而非IgE依赖的过敏原检测方法也因商业性的嗜碱性粒细胞活化试验诞生，弥补了IgE依赖的过敏原检测方法的不足，但技术尚未成熟。

1 体内检测方法

1.1 皮肤试验 皮肤试验是诊断IgE介导的Ⅰ型变态反应的一线方法。其临床价值在于通过皮肤对变应原的反应代替全身性过敏反应(鼻、肺、眼、肠道)，因为其简单、直观、成本低且安全性高，是目前应用最广泛的方法[1]。

1.1.1 皮肤点刺试验(skin prick test，SPT) SPT是通过特制的点刺针将皮肤浅层刺破，使特定的变应原渗入皮肤组织，IgE结合变应原后与真皮的肥大细胞膜FсεR1受体交联，致敏肥大细胞脱颗粒，释放组胺和其他炎性介质，引起皮肤局部毛细血管扩张和通透性增加，表现出风团和红斑样改变[1]。若与阴性对照(生理盐水)比较，风团直径>3 mm为阳性，若风团直径<3 mm，同时组胺(阳性对照液)呈阳性，则认为结果为阴性[2]。

SPT被认为是可靠的过敏原检测方法，其与血清特异性IgE的符合率达80%～90%。患者SPT阳性或者过敏原特异性IgE(specific IgE，sIgE)升高均证明对该过敏原敏感(即“敏化”)，但敏感患者需暴露后产生临床症状才称之“过敏”。汤建萍[3]研究表明，SPT阳性预报正确率<50%，而阴性预报正确率>95%，说明SPT阴性可基本排除该过敏原IgE介导的过敏，而SPT阳性还需激发试验进一步确诊。欧洲人群中，SPT对哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎和食物过敏的临床阳性预测值可达80%，而且风团越大，过敏的可能性越高[1]，但其大小与过敏的严重程度无相关性，SPT不能用于疾病的危险程度评估。SPT适用于Ⅰ型变态反应的疾病包括：过敏性哮喘、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、食物过敏、青霉素/毒液/乳胶过敏，且任何年龄的患者均可，但不同年龄的反应性有差异，如婴儿的阳性反应较小。近1个月有全身性过敏反应(可使皮肤暂时无反应)及一些药物会造成假阴性结果，故试验前应停用抗组胺药物4～5 d，且3周内避免在进行皮肤测试的地方使用皮质类固醇[1]。因过敏原直接作用于人体，有发生过敏性休克的风险，哮喘急性期、强烈的过敏发作期以及不配合的儿童不适合做点刺试验[3]。另外，SPT的结果判断受技术和所用试剂的影响[2]，其传统的致敏剂是天然过敏原提取物，目前已有重组或高纯度的致敏蛋白标准品应用于临床[4]。

1.1.2 皮内试验 皮内试验是将比SPT更低浓度和剂量的过敏原提取物注射至皮内，15～20 min后读取结果。既可用于评价IgE介导的速发性变态反应，也可用于评价迟发型变态反应。主要适用于疑似呼吸道过敏但SPT阴性、毒液和药物过敏的病例[1]。皮内试验的禁忌证与SPT无异，为安全起见，皮内试验前必须先行SPT，与SPT相比，其具有更高的敏感性和更低的特异性[1]，但其发生不良反应的风险更大也更严重。

1.1.3 特应性斑贴试验(atopy patch test，APT) APT是通过患者的皮肤长时间(通常为48 h)暴露于接触性变应原，诱发细胞介导的迟发型变态反应[1]，常在第72小时解读反应结果，是诊断过敏性接触性皮炎的金标准[5]，但近期才被用于评估食物过敏。因其安全性高，儿童也推荐使用[6]。此法适用于怀疑潜在或继发性过敏性接触性皮炎的患者[6]；或SPT和sIgE均阴性但怀疑有过敏反应者；或多种sIgE(+)，但无法证实与临床关联的特应性皮炎患者[3]；或食物过敏中怀疑为迟发型反应者[7]。对于牛奶和鸡蛋过敏，APT联合sIgE检测的阳性预期值达到94%以上，无需食物激发试验再进一步确诊[8]。

该方法中，接受全身皮质类固醇、环孢素或霉酚酸酯等免疫抑制剂治疗者可能出现假阴性结果，但抗组胺药物对结果无干扰[5]。对APT部位进行局部皮质类固醇、局部钙调神经磷酸酶抑制剂或紫外线照射可抑制斑贴试验反应，故APT前5～7 d内不应涂抹皮质类固醇或钙调神经磷酸酶抑制剂，APT前2～4周不要晒黑或日光浴[5]。APT目前在国际上已有4 000多种变应原，对特应性皮炎的诊断有重要意义。但APT易受抗原浓度过低、受试者皮肤反应性下降、方法学的错误等影响，据估计，其假阴性结果高达30%[5]，对特应性皮炎检测的阳性率低于SPT和体外实验，但其与临床病史有显著相关性，特异性更好。

1.2 口服食物激发试验 口服食物激发试验是诊断食物过敏的金标准[9]，由于皮肤试验和过敏原sIgE检测不能将“敏化”与“过敏”区分开，常需口服食物激发试验来证实或排除食物过敏或其是否消退。本试验需在医院内进行，需准备好急救药物和设备；食物过敏原一般从10 mg开始给予，如未出现有关过敏症状，则每隔15～60 min将剂量加倍，直到增至8～10 g。若试验过程中出现速发性过敏反应，或特应性皮炎积分指数增加10分以上为阳性；若无症状出现，则可排除该食物过敏[3]。该试验风险较大，可能导致严重的过敏反应；检测时间较长、昂贵、费力、需要专门的环境，而且激发试验的方案一直无法完全标准化，临床应用较少。

2 体外检测方法

2.1 血清总IgE和sIgE IgE检测是评估可疑过敏反应的基本方法[1]，较体内检测方法更安全、简单、不受抗组胺药物影响，具有重复性强、精确性高和可定量等优点，但不同试剂和生产商之间的结果存在较大差异[10]。对于儿童患者，不同年龄的血清IgE水平有明显差异，脐带血IgE水平很低(<0.5 IU/mL)，出生后随年龄增长而逐渐升高，12岁时达成人水平(20～200 IU/mL)，一般认为>333 IU/mL时为异常升高。但总IgE只是对过敏性疾病的粗略判断，总IgE增高也可见于除过敏外的其他疾病：如寄生虫感染、支气管肺曲霉菌病、部分吸烟者、多发性骨髓瘤、某些原发性免疫缺陷(X连锁免疫失调内分泌肠病综合征、Omenn综合征、Wiskott-Aldrich综合征、Comel-Netherton综合征和高IgE综合征)等[11]。反之，总IgE正常或减少并不能排除过敏[1]。一些样本量较大或研究人群同质性更强的研究发现，发生特异性IgE浓度更高的患者发生重度反应的风险更大[12]，但靶器官敏感性差异、患者的一般健康状态、变应原摄入量等相关因素影响，其实血清sIgE浓度不能可靠地预测反应的严重程度。

2.1.1 sIgE的单一检测分析 sIgE的检测主要通过免疫方法，包括免疫荧光法、免疫印迹法、酶联免疫吸附法、荧光酶免疫分析、化学发光分析或放射过敏吸附分析等[13]。免疫荧光法检测总IgE和sIgE是国际上体外过敏原诊断的金标准[3]。国内IgE检测主要是免疫荧光法(phadia)、免疫印迹法(敏筛、欧蒙、浙大迪讯等)和酶联免疫吸附法(浩欧博、浙大迪讯等)，三者在过敏原检测种类、用血量方面均明显提升。目前国内唯一提供定量检测的方法是免疫荧光法，其过敏原检测种类在2019年已更新至31种，用血量40 μL血清/种，但其价格偏高。免疫印迹法，一般为成套检测，分食物过敏套餐、吸入过敏套餐和食物吸入套餐等，组合项目有29项，包含过敏原60种，用血量300 μL血清/项，因其通量大，价格适中，用血量少，具有极高的特异性和敏感度，在国内使用最广泛。酶联免疫吸附法检测sIgE较免疫印迹法价格贵、检测项目偏少，共有18个组合项目，用血量200 μL血清/项，但其可于体外定量检测血清特异性IgG浓度，临床上更常用于辅助诊断IgG介导的食物不耐受。

2.1.2 sIgE的多重分析 变应原微阵列，近年来已在国外广泛应用，国内也已引进相应设备和试剂，其优点是省时、高效、精准、高通量平行检测、结果可靠[3],但可导致临床的过度诊断[14]。已应用于临床的是免疫固相变应原芯片系统，其包含112种过敏原。还在开发的有欧洲的MeDALL芯片(含170种过敏原)、澳大利亚的Alex(含有282种试剂，包含157种过敏原提取物和125种重组或高度纯化的致敏蛋白)。变应原微阵列还可评估除血清或血浆外的液体中特异性IgE的情况[1]。如免疫固相变应原芯片在春季角结膜炎患者泪液中检测到食物过敏原sIgE，甚至有些是血清中没有的sIgE[15]。另外，Schmid等[16]观察到治疗前过敏原sIgE可能控制IgG4的诱导，而在增加皮下免疫治疗剂量后，免疫固相变应原芯片测得sIgE水平明显降低，IgG4水平升高，提示可通过sIgE水平评估免疫治疗疗效。免疫固相变应原芯片由于能同时检测sIgE和过敏原特异性IgG4[17]，而被认为也是过敏原免疫治疗的疗效监测手段。

2.1.3 (变应原)组分解析诊断 也称“分子变应原”诊断法，与传统sIgE检测方法不同，其变应原是通过液相色谱/质谱等技术纯化天然过敏原[18]或通过重组技术获得的单一蛋白或多肽组分[19]，而非提取物整体，避免一些同源蛋白的交叉反应导致检测结果呈阳性，但不具有临床意义，却造成食物过敏的过度诊断。组分解析诊断有助于提高检测的特异性，建立个体的初级和交叉反应致敏谱[20]，定制更详细的不同过敏原的风险评估，帮助制定饮食建议，减少患者不必要的饮食回避。但目前只有吸入性变应原和1种食物(榛子)变应原应用于市场，组分解析诊断的大多数变应原仍处于实验研究阶段[18]。

2.2 嗜碱性粒细胞活化试验(basophil activation test，BAT) 嗜碱性粒细胞是可从外周血中获取的特异性致敏效应细胞，是研究sIgE/FcεRI依赖的脱颗粒作用的良好对象[1]。最常见的BAT是直接用抗原激活嗜碱性粒细胞，采用流式细胞仪检测嗜碱性粒细胞上特定表面抗原如CD63、CD203c的表达，或测定其活化后脱颗粒产生的活性物质(主要是组胺)[21]。但约10%的细胞捐赠人群有“无能”嗜碱性细胞，即BAT中的无反应者[22]。为识别这些无反应者，需抗IgE或抗-FcεRI作为BAT的阳性对照[23]，而试验结果评估的最佳指标是CD63+/抗-FcεRI比值[24]或曲线下面积[25]。

BAT可用于评价IgE介导及非IgE介导的(类)过敏反应[26]，诊断各种吸入性过敏原(花粉、屋尘螨和猫屑)、食物(包括与花粉有关的食物过敏)、天然胶乳、昆虫毒液、某些药物(主要是箭毒和β-内酰胺类抗生素)引起的过敏性疾病及有抗FcεRI或抗IgE自身抗体的慢性荨麻疹[19,23]，甚至可作为脱敏治疗的疗效指标[23]。因为嗜碱性粒细胞活化是一种生物学反应，且不受抗组胺药物影响，BAT阳性可说明临床过敏，诊断的准确性高于皮肤试验及sIgE检测[27]，安全性高于激发试验及斑贴试验。BAT可识别不同严重程度的过敏表型，如牛奶过敏更持久且更严重者的嗜碱性粒细胞在体内对牛奶的反应更强[28]；BAT可区分牛奶过敏儿童中哪些仍存在过敏，哪些过敏反应已随年龄增长消失但仍存在敏化[29]。但BAT检测技术难度大，虽然已有商业化检测试剂盒问世，但对其结果的界定和解释尚无统一标准，尚需继续的研究和开发[1]。

2.3 嗜酸性粒细胞和嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(eosinophil cationic protein，ECP) 活化的嗜酸性粒细胞是迟发相Ⅰ型变态反应的主要细胞，ECP是其释放的最具细胞毒性的生物活性蛋白[3]，过敏患者的ECP水平在予抗过敏药物或特应性免疫治疗时会明显下降[30]。虽然ECP水平易受性别、种族、吸烟习惯、寄生虫和药物等混杂因素的影响[30]，不适用于过敏原的筛查，但ECP可作为过敏性疾病病情活动与治疗疗效的指标[3]。酶联免疫吸附法常用于测定血液、痰液等标本中的ECP水平，其成本低、简便、快捷、不需特殊仪器。

过敏原检测方法在临床应用时需考虑以下三点:患者个体情况、怀疑的发病机制(IgE或非IgE介导)及各种检测方法的优势与局限性，选出最合适的检测手段。无论用哪种过敏原检测方法，都需要结合病史和体格检查来诊断。为了确定食物过敏的严重程度、区分敏化与临床过敏和评估疗效，更好地诊治过敏性疾病，还需改进现有检测方法或开发新的方法。