CYP2C19基因多态性与急性脑梗死患者中氯吡格雷抗血小板效果的分析

郁金凤

（南京大学医学院附属鼓楼医院输血科，江苏 南京 210008）

研究表明，拜阿司匹林联合P2Y受体拮抗剂的抗血小板治疗对改善急性期脑梗死患者的预后和降低复发率至关重要[1]。氯吡格雷是国内常用的P2Y受体拮抗剂，然而，临床研究发现部分患者常规服用氯吡格雷后仍有发生血栓事件的风险[2]，分析原因显示，CYP2C19基因多态性是造成氯吡格雷反应变异性的原因之一，既往研究显示，携带1 种或2 种CYP2C19变异等位基因的患者将氯吡格雷转化为活性代谢产物的能力降低[3]，因此，CYP2C19基因多态性是在基因层面决定氯吡格雷治疗对血小板功能影响的重要原因。目前有多种方法可检测血小板功能，PFA-200 P2Y法是近年来新兴的血小板功能检测方法，被用于氯吡格雷的药效检测。有研究评估了PFA-200 P2Y法与其他常用血小板功能检测方法对口服氯吡格雷患者血小板功能检测结果的差异[4-5]，但CYP2C19基因多态性联合PFA-200 P2Y法评价氯吡格雷临床疗效的相关性研究较少。基于此，本研究探究PAF-200 P2Y和LTA两种方法检测氯吡格雷治疗后的血小板功能，进而评估CYP2C19基因多态性与氯吡格雷临床疗效的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 回顾性研究分析2018 年1 月至2018 年12月就诊于本院的72 例急性期脑梗死患者的临床资料，其中男43 例，女29 例；年龄20～89 岁，平均（64.03±11.34）岁。患者家属均对本研究知情并签署知情同意书。本研究经本院伦理委员会审核批准。纳入标准：符合中国急性缺血性脑卒中诊疗指南中的诊断标准；发病＜14 d；年龄＞18岁；头颅CT 或MRI 诊断有新发脑梗死。排除标准：存在氯吡格雷或阿司匹林过敏史；NHISS＞18分；近3个月有严重的出血性疾病、严重外伤、手术患者；服用对血小板功能有影响的药物；妊娠期或哺乳期患者；严重肝肾功能损伤，肾小球滤过率（eGFR）＜20 mL/（min·1.73m2）；血小板计数（PLT）≤100×109/L，红细胞压积（HCT）＜30%。

1.2 方法

1.2.1 临床资料采集 采集患者基本资料及脑血管疾病相关危险因素，包括性别、年龄、身高、体重指数、个人史、既往病史、用药情况、实验室检查结果、住院时间、有无急性期并发症等内容。

1.2.2 主要试剂与仪器 小板功能分析仪PFA-200 及配套INNOVANCE PFA P2Y 试剂盒（德国SIEMENS），CRONO-LOG Model 700 血小板聚集仪及ADP 试剂（美国CHRONO-LOG），3.2%枸橼酸钠抗凝的真空采血管。

1.2.3 PFA-200 P2Y检测血小板闭合时间 严格按照产品配套说明书进行操作，首先查看触发液是否足够，待仪器加热至37 ℃，进行自我测试。之后，将800 μL枸橼酸钠抗凝全血加入到P2Y试剂盒中，实验结果记录为血小板闭合时间CT（单位s）。＞300 s的检测结果仪器显示为“non-closure”，为便于统计分析，将“non-closure”结果记录为300 s。

1.2.4 LTA检测ADP诱导的最大血小板聚集率（LTA-ADPMAX）取3.2%枸橼酸钠抗凝静脉血，首先1 500 g离心15 min获得富血小板血浆（platelet rich plasm，PRP），取500 μL加入反应杯中；剩余标本1 500 g离心15 min获得贫血小板血浆（platelet poor plasm，PPP）。以PPP为参照，在PRP中加入ADP诱导剂（终浓度5 μmol/L）诱导血小板聚集，透光度改变的最大值记录为最大血小板聚集率（LTA-ADPMAX）。

1.2.5 氯吡格雷抵抗（CR）诊断标准及分组 以传统血小板功能检测方法LTA（吸光度比浊法）为检验的金标准，根据Agarwal等相关研究结果，将LTA-ADPMAX＞50%定义为CR[6]。

1.2.6 CYP2C19 基因检测 CYP2C19 基因型检测由本院病理科完成。根据CYP2C19 基因型结果，将CYP2C19 基因野生纯合子*1/*1 定义为为氯吡格雷快代谢型（extensive metabolizers，EM）；野生型和突变基因杂合子*1/*2 或*1/*3为氯吡格雷中间代谢型（intermediate metabolizers，IM），将纯合子突变*2/*2、*3/*3、杂合双突变*2/*3 定义为慢代谢型（poor metabolizers，PM）。

1.3 观察指标 所有患者均服用氯吡格雷＞3 d 后，采用PFA-200 P2Y、LTA两种方法测定血小板功能。分析CYP2C19基因多态性与血小板功能检测结果、CR 发生率及住院时间的关系。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量资料以“±s”表示，比较采用t检验，计数资料用[n（%）]表示，比较采用χ2检验，采用Pearson 相关系数和简单线性回归分析PFA200、LTA检测结果的相关性，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组临床资料比较 根据CYP2C19 基因型结果分为快代谢组（EM 组，n=27）、中间代谢组（IM 组，n=32）、慢代谢组（PM 组，n=13），占比分别为37.5%、44.4%、18.1%，其中45 例（62.5%）患者携带CYP2C19*2 或*3 等位基因突变。3 组患者年龄、性别、BMI、吸烟史、既往史、实验室检查等临床资料比较差异无统计学意义，见表1。

表1 3组临床资料比较Table1 Comparison of clinical date among three groups

2.2 3 组PFA-200 法与LTA 法检测CR 发生率比较 EM 组患者PFA200 P2Y 检测的血小板功能闭合时间为（287.04±46.03）s，长于IM 组（226.66±93.43）s 和PM 组（189.00±117.21）s，差异有统计学意义（P＜0.05）。EM 患者LTA 法检测ADP 诱导的最大血小板聚集率为（47.74±22.97）%，低于IM组（53.11±26.01）%和PM组（69.00±17.95），差异有统计学意义（P＜0.05）。PFA-200 P2Y 检测法和LTA 法均显示EM组、IM 组和PM 组CR 发生率分别为11.1%、15.6%、46.2%和44.1%、50.0%、92.3%，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 PFA-200 P2Y 与LTA 血小板功能检测相关性分析Pearson 相关性和简单线性回归分析显示，PFA-200 P2Y 与LTA 检测结果呈负相关性（r=-0.365，P=0.001），回归方程为PFA（s）=312.65-1.41LTA（%）。

2.4 3组患者住院时间比较 EM组、IM组和PM组患者住院时间分别为（11.04±3.31）、（11.31±3.97）、（10.77±5.24）d，差异无统计学意义。

3 讨论

抗血小板治疗是急性期脑梗死的特异性治疗方法之一，氯吡格雷作为一种抗血小板药物已广泛应用于脑梗死的治疗。POINT 研究显示，发病早期（12 h 内）使用阿司匹林联合氯吡格雷治疗90 d可降低缺血性卒中复发风险[7]。然而，氯吡格雷的效果存在个体差异，部分患者对氯吡格雷反应低下，称为氯吡格雷抵抗。在研究氯吡格雷抵抗的各种机制中发现，细胞色素P450酶同工酶系统中的CYP2C19基因在氯吡格雷的代谢过程中起关键作用。氯吡格雷为血小板P2Y12受体拮抗剂，本身是一种无药理活性的前体药物，经消化道吸收后，约85%的药物在肠道被酯酶水解为无活性物质，15%经肝脏CYP450酶介导的两步氧化过程代谢为活性产物。其活性代谢产物通过与血小板表面受体P2Y12 结合抑制血小板的活化和聚集，从而发挥抗血栓作用。CYP2C19基因在氧化过程中均发挥作用[8]。

CYP2C19基因具有高度多态性。Zhang等[9]研究显示，亚洲人群中CYP2C19*2、CYP2C19*3 变异等位基因携带者比例达60%，明显高于高加索人群（约30%）。本研究中CYP2C19*2、*3 变异等位基因携带者比例为62.5%，与上述报道类似。既往研究显示携带CYP2C19 功能缺失型等位基因的患者口服氯吡格雷治疗PCI 术后心肌梗死患者具有更高的心血管事件发生率[10]，而在脑梗死患者中，Jia 等[11]研究发现，CYP2C19 基因多态性对氯吡格雷抵抗的发生和疾病的预后有很大影响，Sun等[12]研究显示，携带CYP2C19功能缺失型等位基因的脑梗死患者具有发生心血管事件的高风险，因此，对于服用氯吡格雷抗血小板的脑梗死患者，检测CYP2C19基因型显得尤为必要。本研究发现3 种代谢类型患者CR 发生率比较差异有统计学意义（P＜0.05），与既往报道结果类似[13]。3种代谢类型住院时间比较差异无统计学意义，但由于随访时间较短，本研究并未分析不同代谢类型与急性期脑梗死患者再发心脑血管不良事件的关系。

为观察血小板对氯吡格雷治疗的反应性，目前临床上应用多种检测方法检测血小板功能。最常用的血小板功能检测方法有LTA、VerifyNow、TEG、流式细胞术及PFA-200 P2Y法等[14]。本研究采用LTA、PFA-200 P2Y 两种方法评估血小板的功能。LTA是最早应用于临床检测血小板功能的方法，目前仍被认为是血小板功能检测的金标准。LTA 通过测量ADP 诱导的富血小板血浆的光学透光度改变评估血小板功能。本研究显示通过LTA 方法可发现不同代谢类型氯吡格雷药效比较差异有统计学意义（P＜0.05）。PFA-200 P2Y 是近年来新兴的血小板功能检测方法，具有操作简便、所需时间短、样本量少、无需繁琐分析前样本准备等优点，PFA-200 P2Y 检测方法可模拟体内血管损伤时，高剪切力下血小板的粘附和聚集功能，具有广泛的临床应用前景。Lim等[15]研究显示，PFA-200 P2Y检测的血小板功能闭合时间（Cut-off值=106 s）可以作为急性冠脉综合征患者再发心脏不良事件的预测指标。而Breet等[16]研究显示通过PFA-100检测发现HPR（Cut-off值=236 s）与支架内血栓、缺血性梗死等临床不良结局之间并无相关性。在急性脑梗的临床研究中，目前并没有临床报道显示PFA-200 P2Y 检测结果与脑梗临床预后的关系。本研究结果显示，与其他血小板功能检测方法相比，EM、IM、PM 3种代谢类型PFA-200 P2Y检测值比较差异有统计学意义（P＜0.05）。通过定义血小板闭合时间Cut-off 值为106 s，本研究发现3种不同代谢类型氯吡格雷抵抗发生率比较差异有统计学意义。此外，PFA-200 P2Y检测方法与LTA检测方法具有中等程度的相关性。由于PFA-200 P2Y检测的最大闭合时间为300 s，超过300 s就显示为non-closure，对于PFA-200 P2Y检测的最佳Cut-off值各研究之间报道也存在差异[17],且有可能相关研究样本量较少，目前仅有少数研究显示PFA-200 P2Y检测方法与其他血小板功能检测方法具有良好的相关性[4，18]，因此，未来需要更多的临床样本评估PFA-200 P2Y检测血小板功能的敏感性和特异性。根据CYP2C19基因多态性，本研究未纳入超快代谢型患者，未来需进一步增加研究的样本量，延长患者的随访时间，评估PFA-200 P2Y的检测的血小板功能与急性期脑梗死患者预后的关系。

综上所述，约62.5%的接受氯吡格雷治疗的急性期脑梗死患者携带CYP2C19*2、*3变异等位基因，PFA-200 P2Y检测血小板功能发现氯吡格雷临床疗效与CYP2C19 基因型之间有明显相关，可为临床治疗提供依据。