金柑果实主要次生代谢产物含量及差异分析

郭鹏妹，秦艳，赵希娟,2,3,4*，焦必宁,2,3*

1(西南大学/中国农业科学院 柑桔研究所)，重庆，400712)2(农业农村部柑桔产品质量安全风险评估实验室(重庆)，重庆，400712)3(农业农村部柑桔及苗木质量监督检验测试中心，重庆，400712) 4(西南大学 园艺园林学院，重庆，400715)

金柑(Fortunella)，属芸香科(Rutaceae)柑橘亚科(Aurantioideae)柑橘族(Citreae)柑橘亚族(Citrinae)真正柑橘类植物(true citrus fruit trees)，原产于我国，在广西融安、阳朔，福建尤溪，湖南浏阳、蓝山等地广泛种植，包括山金柑(F.hindsiiSwingle)、罗浮(F.margaritaSwingle)、罗纹(F.japonicaSwingle)、长叶金柑(F.polyandraTanaka)、金弹(F.crassifoliaSwingle)和长寿金柑(F.obovataTanaka)等品种。其中，金弹、罗浮、罗纹和山金柑常用于鲜食和加工，长寿金柑多用于盆景观赏[1-3]。金柑果实味道香甜，皮肉可同食，含有丰富的维生素、矿物质、有机酸等营养物质及类黄酮、酚酸等次生代谢产物[4-5]。金柑具有健胃理气、止咳化痰的功效，果实提取物具有抗氧化、消炎、抗癌、抗菌等生理功能[6-10]。这些健康功能与次生代谢产物有着密切的联系。

金柑虽为柑橘族植物，但是在类黄酮的种类和含量上与柚、橙、宽皮柑橘等柑橘具有明显的差异[11-12]，除橙皮苷、野漆树苷等常见类黄酮，金柑还含有独特的类黄酮，如金柑苷、根皮素-3′，5′-二-C-葡萄糖苷等。LOU等[13]在未熟金柑的水提取物中鉴定出7种类黄酮，郑洁[14]检测了金柑果实中的9种类黄酮，但这些研究中涉及的类黄酮种类较少。此外，香豆素和生物碱也是柑橘中重要的次生代谢产物[15-17]，柚类黄皮层和白皮层中的香豆素，枳实、枳壳中的生物碱也常被研究鉴定[18]，不同种类金柑中香豆素、生物碱的筛查与研究却不多。柠檬苦素和诺米林作为柑橘中2种重要的类柠檬苦素，也是影响柑橘苦味的重要物质[19]，孟鹏[20]曾在研究中优化了提取、纯化和检测柠檬苦素的方法。综上所述，现阶段对金柑中的次生代谢产物测定的种类和数量偏少，需要更全面与系统的研究。

为进一步探索不同种类金柑的价值，本研究基于超高效液相色谱串联三重四级杆质谱法(ultra-performance liquid chromatography tandem triple quaternary mass spectrometry, UPLC-QqQ-MS/MS)对金柑果实中次生代谢产物进行筛查和定量，次生代谢产物包括31种类黄酮，8种酚酸，3种类柠檬苦素，5种生物碱和19种香豆素。通过统计、聚类分析对6种金柑中的66种次生代谢产物进行综合分析，研究不同种类金柑间次生代谢产物的差异，为金柑果实在食品加工、医药等领域的深入研究提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1 样品材料

本研究中采用的金柑果实均于2019年12月上旬采摘自中国农业科学院柑橘研究所国家柑橘种质资源圃(29°83′N，106°43′E)。在长势相近的果树的不同方位均匀地采摘成熟、大小适宜、无病虫害的金柑果实。采摘后的金柑果实用超纯水清洗，擦干，制备鲜样，密封避光存于 -20 ℃冰箱备用。样品信息和图片如表1和图1所示。

表1 6种金柑果实信息Table 1 Information of six kumquat fruits

a- 温州罗浮；b- 融安金弹；c- 宁波罗纹；d- 金豆；e- 长寿金柑；f- 金柑杂种图1 六种金柑果实的样品图Fig.1 Pictures of six kumquat fruits

1.2 标准物质与试剂

甲酸(色谱纯)，上海吉至生化科技有限公司。

本研究使用66种标准物质，包括31种类黄酮、8种酚酸、3种类柠檬苦素、5种生物碱、19种香豆素。标准物质的纯度和供应商信息如下：牡荆素鼠李糖苷(98.07%)、野漆树苷(98.48%)、金合欢素(99.44%)、甜橙黄酮(98%)、川陈皮素(99.71%)、桔皮素(98.49%)、芦丁(99.05%)、芸香柚皮苷(99.38%)、柚皮苷(98.55%)、橙皮苷(97.06%)、新橙皮苷(98.76%)、香蜂草苷(99.3%)、枸橘苷(98.4%)、橙皮素(98.6%)、根皮素(98.9%)、原儿茶酸(98.12%)、对羟基苯甲酸(99.9%)、咖啡酸(99.28%)、香草酸(98.8%)、p-香豆酸(99.84%)、芥子酸(98%)、阿魏酸(99.95%)，上海安谱实验科技股份有限公司；半齿泽兰素-5-甲醚(95%)、异橙皮内酯(98%)、欧前胡素(99%)、异欧前胡素(99%)，上海源叶生物技术有限公司；维采宁-2、斯皮诺素、地奥司明、新地奥司明、香叶木素、5，7，3′，4′-四甲氧基黄酮、3′，4′，5，5′，6，7-六甲氧基黄酮、蔓荆子黄素、5-降甲基蜜桔黄素、5-羟基-7，8，4′-三甲氧基黄酮、香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、新圣草枸橼苷、甲基橙皮苷、柚皮素、柠檬苦素、诺米林、甜菜碱、东莨菪亭、异补骨脂素，纯度均大于98%，成都克洛玛生物科技有限公司；黄柏酮、绿原酸、柠檬内酯(98.2%)、香柑醇、花椒毒素、佛手柑内酯，纯度均大于98%，北京金谛泽浩科技有限公司；大麦芽碱(97.5%)、酪胺(98.5%)、橙皮内酯水合物(90%)、橙皮油素(98.5%)、6′，7′-二羟基香柠檬亭(97.8%)、6′，7′-环氧香柠檬亭(95.1%)、甲醇、乙腈(色谱纯)，Sigma-Aldrich (USA)；N-甲基酪胺(99.5%)、滨蒿内酯(95%)、5-牻牛儿醇基-7-甲氧基香豆素(99.9%)、8-牻牛儿醇基补骨脂素(98.5%)、香柠檬素(96.9%)、补骨脂素(99.1%)，ChromaDex (USA)；章鱼胺(99.3%)、伞形花内酯(99%)，Dr.Ehrenstorfer GmbH (Germany)。所有标准物质均使用甲醇配制，存于 -80 ℃冰箱。标准物质混合溶液(下文中简称“混标”)中所有酚酸类物质的质量浓度为400 μg/L，章鱼胺的质量浓度为1 000 μg/L，其他标准物质质量浓度为100 μg/L。

1.3 仪器设备

KQ5200DE 超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司；Milli-Q Advantage A10 超纯水机，Millipore (USA)；3K15 高速冷冻离心机，Sigma-Aldrich (USA)；PB3002-S/FACT 分析天平，Mettler Toledo (Switzerland)；有机相针式滤器 (13 mm，0.22 mm)，上海安谱实验科技股份有限公司；Acquity UPLC HSS T3色谱柱，Waters (USA)；Nexera X2 UPLC，Shimadzu (Japan)；QTrap®6500+，AB SCIEX (USA)。

1.4 UPLC-QqQ-MS/MS测定

1.4.1 次生代谢产物的提取

将5.0 g待测样品置于离心管，加入15.0 mL甲醇后摇匀，超声提取30 min(25 ℃，200 W)，10 000 r/min下离心5 min，取上清液移至50.0 mL容量瓶。上述提取和离心步骤重复1次，将2次提取的上清液合并，用甲醇定容至50.0 mL。上机前使用0.22 mm有机相针式滤器过滤提取液并将其置于进样小瓶。

1.4.2 UPLC-QqQ-MS/MS设备及条件

本研究测定次生代谢产物使用的设备为Shimadzu Nexera X2超高效液相色谱与SCIEX QTrap®6500+联用。色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 mm，Waters)，色谱柱温度为40 ℃，流速为0.3 mL/min，进样量为1.0 μL，样品室温度为15 ℃，流动相A为含有体积分数0.1%甲酸的纯水,流动相B为乙腈，梯度洗脱程序如下：0～3 min：10%B～30%B;3～8 min：30%B～80%B;8～8.5 min：80%B～95%B;8.5～12 min：95%B～95%B;12～12.1 min：95%B～10%B;12～15 min：10%B～10%B。进样前后，使用500.0 μL 50%甲醇水冲洗进样针。

质谱离子化模式为电喷雾离子源(turbo spray)，正离子模式(ESI+)和负离子模式(ESI-)，采集模式为程序多反应监测模式(scheduled multiple reaction monitoring， sMRM)，离子源温度500.0 ℃，气帘气(CUR)35.0 psi，雾化气(GS1)50.0 psi，辅助气(GS2)50.0 psi，喷雾电压(IS)+5 500.0 V和-4 500.0 V。入口电压(EP)和碰撞室出口电压(CXP)为10.0 V和15.0 V。化合物的MRM参数，包括离子种类，前体离子，产物离子，去簇电压(DP)和碰撞能量(CE)，定量MRM离子对等参照GUO等[21]和ZHAO等[22]的方法。

1.4.3 方法学验证

每种标准物质使用至少5个适宜浓度的溶液进行实验，通过对每种标准物质的含量及其MRM定量离子对所对应的峰面积进行线性拟合得到线性回归方程，其线性相关系数均大于0.99；日间差是采用连续3 d对同一标准溶液测定的实际浓度的相对标准偏差表示，日内差则是同一天对同一标准溶液连续3次进样测定的实际浓度的相对标准偏差表示，各物质的日内差和日间差分别小于5.60%和5.80%；检出限指信噪比≥3时对应的物质的浓度，定量限则为信噪比≥10时对应的物质的浓度，所有物质的检出限范围为0.001～9.57 μg/L，定量限范围为0.004～21.85 μg/L；本研究采用金柑杂种进行回收率实验，将适宜浓度的标准品注入金柑杂种果实的提取液中，通过计算提取前后浓度差值与实际注入浓度的比值得到回收率，各物质的回收率均在70%～120%。

1.5 数据采集与分析

LC-MS/MS操作和数据采集在Analyst®软件(SCIEX)上进行，使用软件MultiQuant®(SCIEX)进行定量。每种样品均重复测定3次，数据结果表示为“平均值±标准差”。使用Excel 2019、SPSS 22.0和Origin 2019b进行分析和绘图。

2 结果与分析

2.1 六种金柑果实中次生代谢产物的靶向筛查

采用UPLC-QqQ-MS/MS方法对6种金柑果实的甲醇提取物中的类黄酮、酚酸、类柠檬苦素、生物碱和香豆素进行筛查，6种金柑中定量的次生代谢产物数量如表2所示，金柑杂种果实中物质最为丰富，高达48种，相较之下，融安金弹和宁波罗纹的物质较少，只有33种。混标和6种金柑果实的甲醇提取物的总离子流图如图2所示，6种金柑的次生代谢产物的种类和含量具有明显的不同。6种金柑中均定量了17种类黄酮、4种香豆素、1种酚酸、3种生物碱和2种类柠檬苦素，分别为：枸橘苷、香蜂草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、新圣草枸橼苷、川陈皮素、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、芦丁、金合欢素、牡荆素鼠李糖苷、野漆树苷、维采宁-2、新地奥司明、地奥司明、香叶木素、斯皮诺素、滨蒿内酯、橙皮内酯水合物、异橙皮内酯、橙皮油素、芥子酸、酪胺、N-甲基酪胺、甜菜碱、柠檬苦素和诺米林。

表2 六种金柑果实中定量的次生代谢产物的数量Table 2 The number of secondary metabolites quantitated in six kumquat fruits

标准物质混合液中1-维采宁-2；2-斯皮诺素；3-牡荆素鼠李糖苷；4-野漆树苷；5-地奥司明；6-新地奥司明；7-香叶木素；8-金合欢素；9-半齿泽兰素-5-甲醚；10-5，7，3′，4′-四甲氧基黄酮；11-甜橙黄酮；12-3′，4′，5，5′，6，7-六甲氧基黄酮；13-蔓荆子黄素；14-川陈皮素；15-桔皮素；16-5-降甲基蜜桔黄素；17-5-羟基-7，8，4′-三甲氧基黄酮；18-香蒲新苷；19-芦丁；20-异鼠李素-3-O-新橙皮苷；21-新圣草枸橼苷；22-芸香柚皮苷；23-柚皮苷；24-橙皮苷；25-新橙皮苷；26-甲基橙皮苷；27-香蜂草苷；28-枸橘苷；29-柚皮素；30-橙皮素；31-根皮素；32-柠檬苦素；33-诺米林；34-黄柏酮；35-章鱼胺；36-甜菜碱；37-N-甲基酪胺；38-大麦芽碱；39-酪胺；40-原儿茶酸；41-绿原酸；42-对羟基苯甲酸；43-咖啡酸；44-香草酸；45-p-香豆酸；46-芥子酸；47-阿魏酸；48-伞形花内酯；49-橙皮内酯水合物；50-滨蒿内酯；51-柠檬内酯；52-异橙皮内酯；53-橙皮油素；54-东莨菪亭；55-5-牻牛儿醇基-7-甲氧基香豆素；56-香柑醇；57-补骨脂素；58-异补骨脂素；59-花椒毒素；60-佛手柑内酯；61-6′，7′-二羟基香柠檬亭；62-欧前胡素；63-异欧前胡素；64-6′，7′-环氧香柠檬亭；65-8-牻牛儿醇基补骨脂素；66-香柠檬素图2 混标及6种金柑果实的甲醇提取物的总离子流图Fig.2 Total ion chromatograms from mixed standards and methanol extracts of six kumquat fruits

郑洁[14]在研究中检测了15种金柑中9种类黄酮、4种酚酸和2种类柠檬苦素的含量，其中5种金柑品种与本研究一致，所检测的5种类黄酮、4种酚酸和2种类柠檬苦素与本研究一致，而在郑洁研究中未检出的物质，如宁波罗纹、温州罗浮、融安金弹和长寿金柑中的牡荆素鼠李糖苷、宁波罗纹中的诺米林等，本研究中均有检出。OGAWA等[23]在研究中检测了5种金柑果皮和汁胞中的橙皮油素，只有香港野生金柑中含有此物质，其他金柑中均未检出，而本研究的金柑果实中均检出橙皮油素。这些研究中只对金柑中的某一种或某几类物质进行测定和比较，分析不够全面，本研究共检测了31种类黄酮，8种酚酸，3种类柠檬苦素，5种生物碱和19种香豆素，采用的UPLC-QqQ-MS/MS方法定量限低，检测的物质较多，更有利于对金柑中的次生代谢产物进行全面、系统的分析。

2.2 金柑果实中类黄酮含量的差异

共测定了31种类黄酮，包括8种黄酮，9种多甲氧基黄酮，3种黄酮醇，10种黄烷酮和1种二氢查尔酮。6种金柑定量类黄酮的数量如表2所示，金柑杂种中类黄酮最多，其中多甲氧基黄酮显著多于其他5种金柑，融安金弹、温州罗浮和宁波罗纹中类黄酮较少。

6种金柑中定量的17种类黄酮中平均含量高于20 μg/g的物质从高到低依次为杜荆素鼠李糖苷、金合欢素、维采宁-2、新橙皮苷、橙皮苷和枸橘苷。由图3可知，6种金柑的类黄酮组成差异较大。

图3 六种金柑果实中类黄酮的含量Fig.3 The contents of flavonoids in six kumquat fruits注：柱状图中物质顺序按箭头所示方向排列；不同的小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)

金柑杂种中的新橙皮苷含量最高(269.60±22.23) μg/g，牡荆素鼠李糖苷、维采宁-2、橙皮苷次之，含量均大于200.00 μg/g，只有根皮素未检出；金豆中金合欢素含量最高为(294.27±18.08) μg/g，牡荆素鼠李糖苷、野漆树苷、枸橘苷和维采宁-2次之，含量均大于10.00 μg/g，芸香柚皮苷和甲基橙皮苷虽有检出但含量低于定量限，无法定量；温州罗浮中含量最高的为枸橘苷(61.55±1.76) μg/g，金合欢素、牡荆素鼠李糖苷、野漆树苷、维采宁-2次之，含量均大于10.00 μg/g，甜橙黄酮、桔皮素、5-羟基-7，8，4′-三甲氧基黄酮、芸香柚皮苷、甲基橙皮苷和橙皮素虽有检出但含量低于定量限，无法定量；长寿金柑中牡荆素鼠李糖苷含量最高为(108.37±6.30) μg/g，维采宁-2、枸橘苷、野漆树苷和金合欢素次之，含量均大于2.00 μg/g，芸香柚皮苷、甲基橙皮苷、柚皮素、甜橙黄酮、橙皮素和5-羟基-7，8，4′-三甲氧基黄酮也有检出，但是含量低于定量限，无法准确定量；融安金弹中含量最高的为牡荆素鼠李糖苷为(35.08±4.52) μg/g，枸橘苷、野漆树苷、维采宁-2、金合欢素次之，含量均大于2.00 μg/g，甜橙黄酮、桔皮素、5-羟基-7，8，4′-三甲氧基黄酮、芸香柚皮苷、甲基橙皮苷、橙皮素、柚皮素和5-降甲基蜜桔黄素也有检出，但是含量低于定量限，无法准确定量；宁波罗纹中牡荆素鼠李糖苷含量最高为(29.99±0.78) μg/g，其他含量大于2.00 μg/g的包括枸橘苷、维采宁-2、野漆树苷和金合欢素，还检出甜橙黄酮、5-羟基-7，8，4′-三甲氧基黄酮、芸香柚皮苷、甲基橙皮苷、橙皮素和柚皮素，但含量低于定量限，无法定量。

从类黄酮的种类来看，大部分柑橘以黄烷酮为主，占比可达81%[11]，如橘、甜橙、柠檬中的橙皮苷，柚、酸橙中的柚皮苷含量都极为丰富[24-27]，本研究中金柑与橘、橙、柚等的类黄酮组成具有较大差异，6种金柑中黄酮含量占31种类黄酮总含量的比例最高，金豆、长寿金柑、融安金弹、宁波罗纹、温州罗浮和金柑杂种中黄酮含量的占比分别为91.20%、89.68%、72.67%、67.55%、64.31%和49.61%。此外，黄烷酮也是金柑中重要的类黄酮物质，金柑杂种、温州罗浮、宁波罗纹和融安金弹中的黄烷酮占比较高，分别为43.31%、35.44%、32.03%和26.84%，长寿金柑和金豆中黄烷酮占比较低，为9.51%和8.53%。值得注意的是，在其他柑橘中含量较为丰富的柚皮苷、芸香柚皮苷、橙皮素在6种金柑中含量较低，新橙皮苷和橙皮苷在金柑杂种中的含量较高，在其他金柑中含量较低，其他金柑中含量最高的黄烷酮为枸橘苷。金柑杂种中9种多甲氧基黄酮的含量占类黄酮总含量的比例为6.75%，而其他5种金柑中多甲氧基黄酮的含量极低，占比均低于0.02%。

在以往的研究中，郑洁[14]检测了温州罗浮、融安金弹、宁波罗纹、长寿金柑和金柑杂种果实干样中的橙皮苷、新橙皮苷、野漆树苷、牡荆素鼠李糖苷和枸橘苷。研究发现金柑杂种中的枸橘苷含量显著低于其他金柑，与本研究结果一致；温州罗浮、融安金弹、宁波罗纹和长寿金柑中未检出牡荆素鼠李糖苷，而本研究在同种类的金柑果实鲜样中均检出牡荆素鼠李糖苷，含量均大于20.00 μg/g；野漆树苷只在温州罗浮、融安金弹和长寿金柑中检出，而本研究还在宁波罗纹和金柑杂种中准确定量了野漆树苷；5种金柑中新橙皮苷含量最高为(211.62～1 771.03) μg/g DW，本研究中除金柑杂种外，其他金柑中的新橙皮苷含量较低，均小于1.00 μg/g。WANG等[28]在四季橘果皮干样中检出了地奥司明、甜橙黄酮、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、芦丁，本研究在所有金柑中也检出这6种物质，因样品、检测方法不同，含量具有一定的差异。KAWAII等[29]在研究中测定了罗纹、金弹和罗浮中的24种类黄酮，其中芸香柚皮苷含量最高，而在本研究中罗纹、金弹和罗浮中虽检出芸香柚皮苷，但低于定量限无法准确定量，样品、提取方法和检测方法的不同可能是造成这种差异的原因。维采宁-2、香蜂草苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、斯皮诺素和香叶木素是首次在金柑果实中检出。相较于前人的研究，本研究采用的测定方法定量限更低，测定的物质更多也更加准确，更有利于全面分析金柑果实中的类黄酮组成。

2.3 金柑果实中酚酸含量的差异

研究共测定了8种酚酸，其中香草酸、对羟基苯甲酸和原儿茶酸属于苯甲酸型(C6—C1)，p-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和芥子酸属于肉桂酸型(C6—C3)，绿原酸属于简单酚酸聚合物。本研究提取的酚酸为游离态酚酸，这8种酚酸在6种金柑中均有检出，但由于部分游离态酚酸在果实内含量低于定量限，无法定量。

如图4所示，6种金柑的酚酸组成有所不同：温州罗浮、长寿金柑、融安金弹和宁波罗纹中的酚酸都以芥子酸为主，含量分别为(12.61±0.33)、(1.59±0.052)、(0.28±0.006 8)和(0.23±0.010) μg/g，所占比例均在80%以上，金豆和金柑杂种中芥子酸的占比较低，分别为0.79%和6.89%；金豆中的酚酸以阿魏酸为主,为(9.67±0.18) μg/g，占所测酚酸总量的74.56%，其他5种金柑中阿魏酸的占比均在11.00%以下；金柑杂种以绿原酸为主为(2.19±0.34) μg/g，占比为89.86%，长寿金柑中的绿原酸可以定量，占比为12.46%，其他金柑中绿原酸含量低于定量限，无法定量。温州罗浮的酚酸总含量最高，与金豆差异不显著，与其他金柑差异显著；金柑杂种的酚酸总含量与长寿金柑的差异不显著，与其他4种金柑差异显著；融安金弹和宁波罗纹的酚酸总含量较低，均在0.50 μg/g以下，且两者差异显著。

图4 六种金柑果实中酚酸的含量Fig.4 The contents of phenolic acids in six kumquat fruits

在郑洁[14]的研究中，温州罗浮和长寿金柑中芥子酸的含量最高，与本研究的结果一致;宁波罗纹和融安金弹中的酚酸以芥子酸和p-香豆酸为主，而本研究中只有金豆中的p-香豆酸可以被定量，含量为(1.25±0.017) μg/g，其他金柑果实中p-香豆酸可被检出，但含量小于定量限，无法定量。造成差异的原因是提取方法不同，郑洁提取的为结合态酚酸，而本研究提取的为游离态酚酸。WANG等[28]在四季橘果皮干样中检出绿原酸、阿魏酸、芥子酸、p-香豆酸和咖啡酸，其中绿原酸含量最高，这与本研究中金柑杂种的测定结果一致。

2.4 金柑果实中香豆素含量的差异

研究共测定了8种普通香豆素和11种呋喃香豆素。每种金柑所含的香豆素种类和含量都不同。如图5所示，从香豆素类物质总含量来看，最高的是金豆,为(47.60±4.06) μg/g;金柑杂种和长寿金柑的总含量均低于3.50 μg/g,且两者差异不显著;融安金弹、宁波罗纹和温州罗浮的香豆素类物质总含量均低于0.50 μg/g。从金柑品种来看，每种金柑的香豆素组成各有不同：温州罗浮中的滨蒿内酯含量最高为(0.058±0.007 2) μg/g，6′，7′-二羟基香柠檬亭和异欧前胡素也有检出，5-牻牛儿醇基-7-甲氧基香豆素、花椒毒素、伞形花内酯有检出，但低于定量限，无法定量；融安金弹的橙皮油素含量最高，为(0.099±0.014) μg/g，6′，7′-二羟基香柠檬亭、花椒毒素和香柑醇也有检出，5-牻牛儿醇基-7-甲氧基香豆素和异欧前胡素有检出，但低于定量限，无法定量；宁波罗纹中的橙皮油素含量最高，为(0.076±0.009 9) μg/g，6′，7′-二羟基香柠檬亭和花椒毒素也有检出，5-牻牛儿醇基-7-甲氧基香豆素含量低于定量限，无法定量；金豆含量最高的为橙皮油素(32.68±3.41) μg/g，花椒毒素、伞形花内酯、异欧前胡素、佛手柑内酯和补骨脂素也有检出，异补骨脂素含量低于定量限，无法定量；长寿金柑中的6′，7′-二羟基香柠檬亭含量最高，为(0.63±0.18) μg/g，香柠檬素、6′，7′-环氧香柠檬亭、花椒毒素、香柑醇和异欧前胡素也有检出，5-牻牛儿醇基-7-甲氧基香豆素含量低于定量限，无法定量；金柑杂种中滨蒿内酯含量最高，为(2.19±0.17) μg/g，异欧前胡素、伞形花内酯和6′，7′-二羟基香柠檬亭也有检出，5-牻牛儿醇基-7-甲氧基香豆素和欧前胡素含量低于定量限，无法定量。

图5 六种金柑果实中普通香豆素和呋喃香豆素的含量Fig.5 The contents of coumarins and furanocoumarins in six kumquat fruits注：金豆的香豆素含量对应左轴，其他金柑的香豆素含量对应右轴；柱状图中物质顺序按箭头所示方向排列；柠檬内酯、东莨菪亭、5-牻牛儿醇基-7-甲氧基香豆素、异补骨脂素和8-牻牛儿醇基补骨脂素在6种金柑中未检出或低于定量限无法被准确定量，故未统计在图中

6种金柑中均检出5种香豆素：滨蒿内酯、欧前胡素、异橙皮内酯、橙皮内酯水合物和橙皮油素。滨蒿内酯在金柑杂种中的含量较高，大于2.00 μg/g，占香豆素总含量的67.96%，其他金柑中其含量均低于0.10 μg/g。欧前胡素在金豆中含量最高，为(10.83±0.47) μg/g，占金豆中香豆素总含量的22.76%，而在其他5种金柑中含量均低于0.01 μg/g。异橙皮内酯在6种金柑中含量范围为2.56～22.79 ng/g，占比均小于3.00%。橙皮内酯水合物在金豆中含量最低,为(6.87±0.52) ng/g，长寿金柑中含量最高，为(144.63±5.20) ng/g。金豆、宁波罗纹、融安金弹、长寿金柑、金柑杂种和温州罗浮中的橙皮油素占香豆素总含量的比例分别为68.66%、35.25%、30.72%、22.81%、22.50%和12.84%。MERCOLINI等[30]在罗浮果实干样中检出橙皮油素和伞形花内酯，OGAWA等[23]检测了香港野生金柑、金弹、罗浮、Marumi金柑和Malayan金柑,橙皮油素只在香港野生金柑的果皮和汁胞中有检出，含量为0.130和0.014 mg/g DW，本研究在6种金柑中均检测到橙皮油素，与香港野生金柑同种的金豆中橙皮油素含量为(32.68±3.41) μg/g，显著高于其他5种金柑，因此，本研究推测山金柑中的橙皮油素含量显著高于其他金柑种类。以往的研究对柚果实中的香豆素测定较多，聂嘉琳等[15]测定了6种柚果实中11种香豆素的含量，而本研究首次测定了金柑果实中19种香豆素的含量，滨蒿内酯、欧前胡素、异橙皮内酯、橙皮内酯水合物等均是首次在金柑中检出。

2.5 金柑果实中类柠檬苦素含量的差异

本研究共测定了柠檬苦素、诺米林和黄柏酮3种类柠檬苦素，具体含量如表3所示。6种金柑的柠檬苦素含量均高于5.00 μg/g，金柑杂种中的柠檬苦素含量最高，为金豆中的16倍，且与其他5种金柑差异显著，金豆中的柠檬苦素含量最低，与其他5种金柑差异显著，融安金弹、宁波罗纹和长寿金柑之间差异不显著；长寿金柑中诺米林的含量最高，是温州罗浮的848倍，温州罗浮中诺米林的含量最低，除宁波罗纹和金豆之间差异不显著外，其他金柑之间差异均显著；6种金柑中的黄柏酮含量较低且均在0.10 μg/g以下。

除枸橼的果皮和果肉中诺米林含量大于柠檬苦素外[31]，大部分柑橘中的柠檬苦素含量均大于诺米林。孟鹏[20]测定了尤溪金柑、赣州脐橙、琯溪蜜柚和广元柑橘干样中柠檬苦素和诺米林的含量，除赣南脐橙外，其他3种样品中柠檬苦素的含量均高于诺米林，本研究测定的6种金柑中类柠檬苦素的含量从高到低依次为：柠檬苦素、诺米林、黄柏酮，可以推测金柑全果中柠檬苦素和诺米林含量与柚、橘等中的规律一致：柠檬苦素>诺米林。

表3 六种金柑果实的类柠檬苦素组分及含量 单位：μg/g

2.6 金柑果实中生物碱含量的差异

研究共测定了5种生物碱，分别为章鱼胺、甜菜碱、N-甲基酪胺、大麦芽碱和酪胺。6种金柑中均检出这5种生物碱，其中甜菜碱、N-甲基酪胺、酪胺均被准确定量，但在温州罗浮、融安金弹、宁波罗纹和金豆中，章鱼胺和大麦芽碱含量低于定量限，无法准确定量。

如图6所示，长寿金柑中的生物碱含量最高，与其他5种金柑差异显著；融安金弹、宁波罗纹和金柑杂种的生物碱总含量之间差异不显著，与其他3种金柑差异显著；金豆和温州罗浮的生物碱总含量差异不显著，与其他4种金柑差异显著。金柑杂种中的主要生物碱为N-甲基酪胺、酪胺和章鱼胺，占比分别为74.67%、13.56%和9.79%，甜菜碱和大麦芽碱的含量均低于0.20 μg/g；长寿金柑中酪胺含量最高，占生物碱总含量的74.01%，N-甲基酪胺次之，占比为24.64%，章鱼胺、甜菜碱和大麦芽碱的含量均在0.50 μg/g以下；融安金弹中的酪胺和N-甲基酪胺的含量分别为(8.61±1.14)和(3.71±0.34) μg/g,占比为68.30%和29.43%；宁波罗纹中酪胺和N-甲基酪胺的占比为72.22%和24.85%，含量分别为(8.57±0.83)和(2.95±0.22) μg/g；温州罗浮中的酪胺、N-甲基酪胺占比分别为62.44%、32.98%。融安金弹、宁波罗纹、温州罗浮中的甜菜碱的含量均低于0.50 μg/g；金豆中酪胺、N-甲基酪胺和甜菜碱的占比为61.79%、24.48%和13.73%，含量分别为(3.92±0.23)、(1.55±0.04)和(0.87±0.081) μg/g。综上所述，金柑杂种含量最高的生物碱为N-甲基酪胺，其他5种金柑中含量最高的生物碱均为酪胺。ZHANG等[32]在研究中测定了宽皮柑橘和甜橙中生物碱的含量，结果表明，除辛弗林外，N-甲基酪胺是主要的生物碱，其次是章鱼胺，金柑杂种是金柑与宽皮柑橘杂交所得，故与宽皮柑橘的生物碱组成相似，其他金柑与宽皮柑橘和橙类组成差异较大。

图6 六种金柑果实中生物碱的含量Fig.6 The contents of alkaloids in six kumquat fruits

2.7 金柑果实中类黄酮、酚酸、生物碱、类柠檬苦素和香豆素5类物质的比较与分析

对6种金柑果实中类黄酮、酚酸、生物碱、类柠檬苦素和香豆素类物质的含量进行聚类分析，结果如图7所示。

图7 类黄酮、酚酸、类柠檬苦素、生物碱和香豆素在不同的金柑果实中的积累规律Fig.7 Accumulation patterns of flavonoids, phenolic acids, limonoids, alkaloids and coumarins in different kumquat fruits注：图中物质的含量进行了归一化处理。如图例所示，物质含量从红到绿依次递减

6种金柑的酚酸、类黄酮、生物碱、类柠檬苦素和香豆素类物质的代谢具有多样性，融安金弹和宁波罗纹的代谢积累模式相近，因此这2个品种在聚类分析中被归为一类，这2种金柑依次与温州罗浮、长寿金柑、金豆和金柑杂种聚类之后组成更高的分类单元，后面4种金柑中的类黄酮、酚酸、生物碱、类柠檬苦素和香豆素的代谢积累模式之间差异较大。

长寿金柑中的10种次生代谢产物的含量显著高于其他5种金柑，包括N-甲基酪胺和酪胺2种生物碱，黄柏酮和诺米林2种类柠檬苦素，橙皮内酯水合物和异橙皮内酯2种香豆素，香柑醇、6′，7′-环氧香柠檬亭、6′，7′-二羟基香柠檬亭和香柠檬素4种呋喃香豆素；金豆中21种次生代谢产物的含量显著高于其他5种金柑，包括斯皮诺素、香蜂草苷、柚皮素、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、野漆树苷、香叶木素、金合欢素和根皮素8种类黄酮，香草酸、阿魏酸、对羟基苯甲酸、p-香豆酸、咖啡酸、原儿茶酸6种酚酸，伞形花内酯、橙皮油素2种香豆素，花椒毒素、欧前胡素、补骨脂素、佛手柑内酯4种呋喃香豆素和甜菜碱1种生物碱；金柑杂种的27种次生代谢产物的含量显著高于其他5种金柑，包括21种类黄酮、2种生物碱、1种酚酸、1种类柠檬苦素、1种香豆素和1种呋喃香豆素，这些物质中包括了9种多甲氧基黄酮，分别为半齿泽兰素-5-甲醚、3′，4′，5，5′，6，7-六甲氧基黄酮、5，7，3′，4′-四甲氧基黄酮、川陈皮素、甜橙黄酮、桔皮素、5-降甲基蜜桔黄素、5-羟基-7，8，4′-三甲氧基黄酮、蔓荆子黄素。

根据《中国果树志·柑橘卷》中的描述，SWINGLE给予金弹种的地位，之后又认为金弹是罗浮和罗纹的种间杂种，但是从形态特征、种子、过氧化物同工酶、GOT等位基因分析又很难证明这种说法，故仍然承认金弹种的地位[2]。王炯等[33]基于COS Marker构建的UPGMA聚类树中金弹和罗纹具有高度一致的遗传组成，这2种金柑再与罗浮、金豆、四季橘聚类之后组成较高级的分类单元。

本研究和王炯等[33]的研究均显示金弹和罗纹代谢积累模式和遗传组成相似，故推测金弹与罗纹之间存在一定的关系。此外，本研究中长寿金柑和金柑杂种均为金柑和柑橘属的杂交，但代谢积累模式相差较大，其母本可能不同。综上所述，以本研究所检测的66种次生代谢产物进行对比，6种金柑中宁波罗纹和融安金弹代谢积累模式相近，温州罗浮、金豆、金柑杂种和长寿金柑差异较大，长寿金柑的差异物质主要为生物碱，金豆的差异物质主要为类黄酮、酚酸和香豆素，而金柑杂种的差异物质多为类黄酮。本研究推测金柑属的金弹和罗纹之间代谢积累模式相近，罗浮、山金柑和长寿金柑之间差异较大，不同种类的长寿金柑因其母本不同也存在一定的差异。

3 结论

本研究采用UPLC-QqQ-MS/MS方法对6种金柑果实的酚酸、类黄酮、类柠檬苦素、生物碱和香豆素类物质进行靶向筛查和定量分析，得到了31种类黄酮、8种酚酸、3种类柠檬苦素、5种生物碱、19种香豆素的具体含量。金柑杂种中检出物质最多，温州罗浮游离态酚酸总含量最高，长寿金柑生物碱总含量最高，金豆的香豆素总含量最高，金柑杂种类黄酮总含量和类柠檬苦素总含量最高；6种金柑的31种类黄酮中，黄酮占比最高，黄烷酮次之，牡荆素鼠李糖苷、野漆树苷和维采宁-2为6种金柑中含量较高的类黄酮；宁波罗纹、温州罗浮、融安金弹和长寿金柑中的酚酸都以芥子酸为主，金豆、金柑杂种则分别以阿魏酸、绿原酸为主；金柑中类柠檬苦素含量大小均为:柠檬苦素>诺米林>黄柏酮；本研究首次对不同金柑中的生物碱和香豆素进行了定量分析，酪胺、N-甲基酪胺、甜菜碱、章鱼胺、大麦芽碱、滨蒿内酯、橙皮内酯水合物、异橙皮内酯等均有检出，其中香豆素含量最高的是金豆中的橙皮油素，金柑杂种中含量最高的生物碱为N-甲基酪胺，其他5种金柑中含量最高的生物碱为酪胺。采用聚类分析对6类金柑中66种次生代谢产物进行分析，结果表明，金柑属的金弹和罗纹(融安金弹和宁波罗纹)代谢积累模式相近，罗浮(温州罗浮)、山金柑(金豆)和长寿金柑之间差异较大。本研究证实了金柑种间和种内果实次生代谢产物具有差异性，研究结果为金柑果实在食品加工和鲜食提供参考，同时也为金柑果实在医药领域的应用提供数据支持。