美洲大蠊活性提取物经胃、肠道给药后的抗肝纤维化作用比较

顾 婷，杨永寿，谢静静，肖培云

（大理大学药学院，云南大理 671000）

由于早期对肝纤维化生物学和病理生理学的了解不够深入，肝纤维化被认为是不可逆的严重肝脏疾病〔1〕，随着医学的发展进步，普遍认为肝纤维化的发展是一个损伤和修复的双向过程，即可以被逆转，从而达到治疗的效果〔2-3〕。已有研究证实，美洲大蠊提取物具有较好的抗肝纤维化作用〔4-9〕。动物药提取物多为蛋白、肽类大分子物质，由于胃和肠道中酶不同，因此降解产物氨基酸序列也不同。虽有研究表明美洲大蠊提取物对肝纤维化大鼠具有较好的治疗作用，但还未有研究证实美洲大蠊提取物在胃中吸收或肠道吸收对其药效是否有影响，而不同吸收途径的选择直接影响美洲大蠊抗肝纤维化制剂剂型的开发。因此本实验通过四氯化碳致大鼠肝纤维化，灌胃给予不同剂型药物，初步评价胃部吸收及肠道吸收对美洲大蠊活性提取物（PA-B）药效的影响，为美洲大蠊抗肝纤维化相关制剂开发及剂型选择提供参考。

1 材料

1.1 实验动物 SPF级SD大鼠，雄性，体质量180~220 g，购自昆明医科大学实验动物中心，许可证号：SYXK（滇）K2015-0002。

1.2 药品与试剂 PA-B肠溶微丸、胃溶微丸（本实验室经泛丸法制备胃溶微丸，包衣锅包肠溶衣制备肠溶微丸，经体内外实验检验肠溶胃不溶，批号：20190905）；秋水仙碱片（云南植物药业有限公司，批号：20181104）；四氯化碳（天津市福晨化工试剂厂，批号：201331120）；橄榄油（欧丽薇兰，益海粮油工业有限公司，批号：20190322）；大鼠丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20191126和20191125）；大鼠透明质酸（HA）、层粘连蛋白（LN）、Ⅲ型前胶原（PC-Ⅲ）、Ⅳ型胶原蛋白（Col-Ⅳ）酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号均为20191203）；羟脯氨酸（HYP）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20191203）。

1.3 仪器 ELX800连续波长酶标仪（Bio-Tek公司）；U570-86超低温冰箱（Eppendorf公司）；LC-4012离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；AL204-IC分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）。

2 实验方法

2.1 动物饲养及分组 SPF级雄性SD大鼠80只，自由采食，自由取水。饲养温度控制在（20±2）℃，相对湿度45%~70%。分笼饲养，饮冷开水，喂食标准饲料，定期清洁消毒，实验过程中遵守实验动物使用及管理原则，所有实验动物实验前均适应性饲养1周。1周后将大鼠按体质量随机分为8组，分别为对照组、模型组、肠溶辅料组、胃溶辅料组、阳性药物组、原料药组（PA-B）、肠溶药物组、胃溶药物组，每组10只。除对照组外，其余各组均被制成肝纤维化模型。

2.2 大鼠肝纤维化模型制备 对照组腹腔注射橄榄油，其余各组腹腔注射40%四氯化碳油剂。每3 d一次，首次注射2 mL∕kg，之后注射1 mL∕kg，每次注射前称重，连续4周〔10-11〕。于第4周末，随机抽取模型组和对照组2~3只取材，进行病理检查，用于判定是否造模成功。

2.3 给药方案 造模成功后，阳性药物组给予0.2 mg∕kg秋水仙碱（0.02 mg∕mL），肠溶药物组给予260 mg∕kg PA-B肠溶微丸（含60 mg∕kg PA-B）药物，胃溶药物组给予234 mg∕kg PA-B胃溶微丸（含60 mg∕kg PA-B），肠溶辅料组给予200 mg∕kg肠溶微丸，胃溶辅料组给予174 mg∕kg胃溶微丸，原料药组给予60 mg∕kg PA-B（6 mg∕mL），对照组及模型组给予等体积0.9%氯化钠溶液，每天灌胃1次，连续4周。

2.4 样品采集及处理 各组末次给药后禁食不禁水24 h，称重，经1%戊巴比妥钠（0.55 mL∕100 g）腹腔注射麻醉后，真空采血管行腹主动脉采血，离心（3 000 r∕min，15 min，4℃），分离血清，分装，-80℃冻存。采血后处死大鼠，将大鼠肝脏完整剖取，0.9%氯化钠溶液冲洗，滤纸拭干，取肝脏左叶同一部位用4%多聚甲醛溶液固定，剩余肝组织分装标号，-80℃储存，以备分析。

2.5 组织病理学观察 将多聚甲醛固定后的大鼠肝组织进行苏木精-伊红（HE）染色、Masson染色，观察各组大鼠肝组织病理变化。

2.6 主要检测指标

2.6.1 ALT和AST测定 根据试剂盒说明书操作，测定血清中ALT、AST含量。

2.6.2 HA、LN、PC-Ⅲ、Col-Ⅳ测定 根据试剂盒说明书，采用ELISA法测定血清肝纤维化4项指标：HA、LN、PC-Ⅲ、Col-Ⅳ。

2.6.3 肝组织中HYP测定 根据试剂盒说明书操作，测定肝组织中HYP含量。

2.7 数据处理 采用SPSS17.0统计软件进行统计分析，实验数据均以（xˉ±s）表示，采用单因素方差分析进行数据统计，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 组织病理学观察

3.1.1 HE染色病理学观察 肝组织HE染色结果见图1，对照组肝组织无纤维组织增生，未发现变性坏死，汇管周围有呈放射状的肝细胞索，肝小叶结构存在。模型组可见肝细胞结构变性，汇管周围大量胶原纤维增生，不同汇管区胶原纤维相互连接成明显的假小叶，肝细胞索排列紊乱无序。胃溶辅料组和肠溶辅料组汇管区纤维增生形成假小叶结构，与模型组相当。其余各治疗组纤维组织增生减轻，未见明显的假小叶结构，肝细胞索排列有恢复呈放射状的趋势，仅在汇管区周围发现少量纤维增生。

图1大鼠肝组织HE染色结果（×100）

3.1.2 Masson染色观察 Masson染色是将胶原纤维染成蓝色，这样能更直观地观察胶原纤维化的形状及分布。对照组肝组织未见明显蓝染，未见胶原沉积，肝小叶结构正常。模型组汇管区周围可见大量蓝色着色，胶原纤维明显增多且较粗壮，胶原纤维相互连接，假小叶结构明显。肠溶辅料组、胃溶辅料组蓝色着色程度与模型组相当，假小叶结构明显。阳性药物组、原料药组、肠溶药物组、胃溶药物组与模型组相比，蓝色着色明显减轻，仅在汇管区附近有少量纤维组织，纤维组织延伸情况减轻，未见假小叶结构，肝细胞索有聚拢趋势。见图2。

图2 大鼠肝组织Masson染色结果（×100）

3.2 指标检测结果

3.2.1 肝功能指标ALT、AST测定 与对照组比较，模型组血清中ALT及AST含量明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，阳性药物组、原料药组、肠溶药物组和胃溶药物组血清中ALT含量降低，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；与阳性药物组比较，原料药组、肠溶药物组、胃溶药物组血清中ALT和AST含量差异无统计学意义（P＞0.05）；与原料药组比较，肠溶药物组、胃溶药物组血清中ALT、AST含量差异均无统计学意义（P＞0.05）；与肠溶药物组比较，胃溶药物组血清中ALT和AST含量降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 大鼠血清中ALT和AST含量测定结果（xˉ±s，U∕L）

3.2.2 大鼠血清肝纤维化4项指标测定 与对照组比较，模型组大鼠血清中HA、LN、PC-Ⅲ、Col-Ⅳ水平升高，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；与模型组比较，阳性药物组、原料药组、肠溶药物组、胃溶药物组HA、LN、PC-Ⅲ、Col-Ⅳ水平均下降，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；与阳性药组比较，原料药组、肠溶药物组、胃溶药物组HA、LN、PC-Ⅲ、Col-Ⅳ水平差异均无统计学意义（P＞0.05）；与原料药组比较，肠溶药物组、胃溶药物组4项指标差异无统计学意义（P＞0.05）；与肠溶药物组比较，胃溶药物组4项指标差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

3.2.3 大鼠肝组织中HYP含量的测定 与对照组比较，模型组大鼠肝组织中HYP含量显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，阳性药物组、原料药组、肠溶药物组、胃溶药物组HYP含量下降，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；与阳性药物组比较，原料药组、肠溶药物组、胃溶药物组HYP含量差异均无统计学意义（P＞0.05）；与原料药组比较，肠溶药物组、胃溶药物组HYP含量差异均无统计学意义（P＞0.05）；与肠溶药物组比较，胃溶药物组HYP含量差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表2 大鼠血清肝纤维化4项指标测定结果（xˉ±s，ng∕mL）

表3 大鼠肝组织中HYP含量测定结果（xˉ±s，µg∕mg）

4 讨论

肝纤维化是肝脏纤维组织的异常增生，早期肝纤维化可被逆转，不继续发展为肝硬化。当前，肝纤维化的评判标准仍是肝组织活检，同时检测肝功能指标及影响肝纤维化的4项指标，可反映出肝纤维化的严重程度。血清中ALT和AST含量测定是国内外广泛应用的反映肝细胞损伤指标，在肝纤维化肝功能受损时，血清中ALT、AST含量往往升高；血清HA、LN、PC-Ⅲ、Col-Ⅳ水平检测，可以动态观察病情演变情况以及判断临床治疗效果，同时也有助于提高肝纤维化诊断的准确性和可靠性；HYP是一类存在于胶原纤维中的蛋白，其含量可直接反映出肝组织中胶原含量的高低，对肝组织中胶原含量的测定具有重要的作用。因此，本实验检测大鼠血清ALT和AST含量，肝纤维化4项指标，结合肝组织中HYP含量，可较好地反映出药物对四氯化碳所致肝纤维化大鼠的改善程度。

本研究结果发现，与对照组比较，模型组胶原纤维增多，假小叶明显，血清中ALT、AST、HA、LN、PC-Ⅲ、Col-Ⅳ、HYP含量升高，表明肝功能受损，肝纤维化模型造模成功；与模型组比较，阳性药物组、原料药组、肠溶药物组、胃溶药物组大鼠胶原纤维、假小叶减少，血清中ALT、HA、LN、PC-Ⅲ、Col-Ⅳ、HYP含量明显降低，表明实验药物对肝纤维化大鼠的肝脏具有一定的保护作用；与阳性药物组比较，原料药组、肠溶药物组、胃溶药物组各指标差异均无统计学意义（P＞0.05）；与肠溶药物组比较，胃溶药物组各指标差异均无统计学意义（P＞0.05）。因美洲大蠊味道让人难以接受，若直接口服原料药，患者依从性不高，因此，可将美洲大蠊活性提取物制备成胃溶制剂，相较于肠溶制剂省去包衣步骤，该方法简单，既能提高患者依从性，又能降低制剂生产成本，保证药物的疗效。