滇西18种豆科植物体外降脂活性研究

郎利娟，姜 北，崔淑君，朱起杰，董 相，肖朝江*

（1.大理大学药物研究所，云南大理 671000；2.大理大学药学院，云南大理 671000）

高脂血症（hyperlipidemia）是指血浆中总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）中一项或多项水平升高超出正常水平上限，是一类较常见的疾病。在我国，成人血脂异常总体患病率高达34%，其发生率近年来也随着生活水平的提高、生活习惯和饮食结构的改变呈逐年上升趋势，我国儿童、青少年高胆固醇血症患病率也有明显升高，预示未来中国成人血脂异常患病及相关疾病负担将继续加重。以LDL-C或TC升高为特点的血脂异常是动脉粥样硬化性心血管疾病（atherosclerotic cardiovascular disease，ASCVD）的重要诱发因素；降低LDL-C水平，可显著减少ASCVD的发病率及死亡危险〔1-3〕。因此，有效控制血脂水平，对防控ASCVD具有重要意义。

豆科（Leguminosae）植物全球约有650属，18 000种，广泛分布于世界各地。我国有172属，1 485种，13亚种，153变种，16变型；各省区均有分布。豆科为被子植物中三个最大的科之一，分布极为广泛，生长环境各式各样，无论平原、高山、荒漠、森林、草原还是水域，几乎都可见到豆科植物的踪迹。豆科植物具有重要的经济价值，它是人类食品中淀粉、蛋白质、油和蔬菜的重要来源之一〔4〕。另外，许多豆科植物还具有良好的降脂活性。例如研究〔5〕发现，从苦参（Sophora flavescens Aiton）中提取分离的苦参碱对血清胆固醇增高的大鼠有一定的降低作用，对高三酰甘油血症有明显的治疗作用。葛根（Pueraria edulis Pamp.）中的有效成分葛根素通过降血糖和降血脂活性表现出抗糖尿病作用〔6〕。大量研究表明，决明子（Cassia obtusifolia L.）也具有良好 的 降 脂 作用〔7-8〕。胡 芦 巴（Trigonella foenumgraecum L.）提取物可改善血脂紊乱，具有显著的降血脂作用〔9-10〕。紫苜蓿（Medicago sativa L.）具有降血脂、抗动脉粥样硬化的作用〔11-14〕。此外，豆科植物的主要药效成分之一大豆皂苷可以降低血液中胆固醇和TG的含量〔15〕。

为了从植物中发现降脂活性较好、副作用较低的天然产物，本研究采用高脂HepG2细胞模型，对采自滇西的18种豆科植物进行体外降脂活性筛选。

1 仪器与材料

1.1 仪器 BSC-1000ⅡA2生物安全柜（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）；5510E CO2培养箱（美国Nuaire公司）；DT5-6低速台式离心机（北京时代北利离心机有限公司）；M700E倒置显微镜（日本Nikon公司）；Varioskan LUX多功能酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Coolsafe 95-15冷冻干燥机（丹麦LaboGene公司）；AL204电子天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；HVE-50高压灭菌锅（日本Hirayama公司）；DW-86L 628-80℃低温冰箱（青岛海尔特种电器有限公司）；RE-5205旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 试药 人肝癌细胞株（HepG2）由中国科学院昆明植物研究所黎胜红研究员惠赠；Gibco澳洲特级胎牛血清、Gibco RPMI 1640干粉培养基均购自美国Invitrogen公司；4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、青霉素-链霉素溶液、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）消化液均购自北京索莱宝科技有限公司；油酸、油红O均购自上海麦克林生化科技有限公司；牛血清白蛋白（BSA）购自德国Biofroxx公司；棕榈酸钠购自上海源叶生物科技有限公司；二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma公司；辛伐他汀购自美国Ark Pharm公司。

1.3 植物样品 18种豆科植物样品均采自滇西地区，由大理大学药学院张德全教授鉴定，植物标本均存放于大理大学药物研究所。植物信息见表1。

表1 18种豆科植物基本信息

2 方法

2.1 植物提取物的制备 18种干燥豆科植物样品粉碎后均采用75%乙醇热回流提取3次，提取液用旋转蒸发仪在50℃以下除去乙醇后，转移至冷冻干燥机上冷冻干燥，得相应冻干粉，备用。

2.2 体外降脂活性测试 参考文献〔16-18〕中的方法，并进行适当改良，具体如下：将HepG2细胞（1.5×104个∕孔）接种于96孔板上，置37℃和5%CO2环境下培养至细胞丰度达90%以上时，以40%BSA结合的0.6 mmol∕L的油酸和0.3 mmol∕L的棕榈酸钠诱导。24 h后，供试组每孔加入20µL供试物溶液，终浓度为0.5 mg∕mL，空白组和模型组每孔加入20µL相应溶媒（粗提物溶媒为灭菌水，辛伐他汀溶媒为DMSO）。继续培养24 h后，小心移除孔内培养液，每孔加入60µL 10%甲醛溶液固定30 min。随后移除固定液，每孔加入60µL 0.4 mg∕mL油红O工作液染色，60 min后用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗3遍，置倒置显微镜下观察细胞内脂滴染色情况。最后每孔加入200µL异丙醇，并用酶标仪测定波长510 nm下各组的光密度（OD）值。降脂率按以下公式计算：降脂率=［1-（供试组OD值-空白组OD值）∕（模型组OD值-空白组OD值）］×100%。

3 结果

对18种豆科植物进行体外降脂活性筛选的结果见表2。从表中可以看出，18种供试植物中有13种（占比70%以上）具有不同程度的降脂活性，推测豆科植物可能普遍具有一定的降脂活性。阳性药物辛伐他汀终浓度为50µmol∕L时，降脂率为（11.4±2.9）%。在所有筛选出的活性植物中，云南甘草地上部分降脂活性最强，终浓度为0.5 mg∕mL时的降脂率可达（21.6±3.9）%；其次是截叶铁扫帚全株、黑毛多枝黄芪地下部分、鞍叶羊蹄甲地上部分，终浓度为0.5 mg∕mL时的降脂率分别为（19.6±10.0）%、（17.8±1.9）%、（15.3±4.6）%。此外，合欢地上部分终浓度为0.5 mg∕mL时，显示出较强的细胞毒性，故其在此浓度下的降脂活性无法测定。

4 讨论

治疗高脂血症除了控制饮食、改善生活方式外，一般还需临床药物进行干预。常用的调血脂药物除了他汀类外，还包括胆固醇吸收抑制剂、胆酸螯合剂、贝特类、烟酸类、高纯度鱼油制剂、普罗布考及其他调脂药（脂必泰、多廿烷醇）等。但是，无论是经典降血脂药还是新型调血脂药，均有不同程度的肝毒性或其他不良反应〔2，19〕，因此，寻找高效、无毒副作用的新型降血脂药物依然任重而道远。目前应用于临床的药物大多源于天然产物，其中又以植物来源为主。自然界中已开发用于治疗疾病的植物数量仅仅只是庞大植物界的冰山一角，因此从药用植物中寻找、发现新的降脂药物的可能性非常大。

表2 18种豆科植物体外降脂活性筛选结果(±s,n=4)

表2 18种豆科植物体外降脂活性筛选结果(±s,n=4)

注：ND表示具有细胞毒性而无法测定。

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文献〔20-21〕报道从鞍叶羊蹄甲茎皮中分离得到了没食子酸，后续研究发现没食子酸具有良好的降脂活性。黄酮类化合物大都具有良好的降脂活性〔22〕。研究者〔23-24〕从云南甘草中分离得到了具有良好降脂活性的黄酮类化合物鹰嘴豆芽素A、芒柄花黄素、黄豆苷元等。张创峰〔25〕从截叶铁扫帚中分离了21个黄酮类化合物，其中也包括具有良好降脂活性的黄酮类化合物异荭草素〔26〕。本研究筛选出鞍叶羊蹄甲、云南甘草、截叶铁扫帚等植物具有良好的降脂活性，结合上述文献报道，推测这些植物的降脂活性物质基础可能为黄酮类或其他酚类化合物，但仍需进一步深入研究验证。另外，豆科植物普遍富含黄酮类化合物，这也可能是本研究大部分植物具有不同程度降脂活性的原因。同时，本研究结果也说明该体外降脂实验方法可行，结果可靠。