野生云南山楂果实化学成分研究

2021-05-20朱起杰郎利娟肖朝江

大理大学学报 2021年4期

朱起杰，郎利娟，姜北，沈怡，王影，肖朝江*

（1.大理大学药物研究所，云南大理 671000；2.大理大学药学院，云南大理 671000）

蔷薇科（Rosaceae）山楂属（Crataegus）植物，我国有18种，云南有7种，包括山楂（C.pinnatifida）、野山楂（C.cuneata）、华中山楂（C.wilsonii）、中甸山楂（C.chungtienensis）、滇西山楂（C.oresbia）、湖北山楂（C.hupehensis）和云南山楂（C.scabrifolia），其中云南山楂主要分布于云南、贵州、四川、广西等地，生长于海拔800～2 400 m的山坡杂木林中或次生灌丛中或林缘〔1〕。山楂作为传统中药，其果肉、叶及核均可入药。迄今为止，研究发现山楂的化学成分主要有黄酮类、三萜类、甾体类、有机酸类及有机胺类等，其中山楂总黄酮成分表现出显著的调血脂作用〔2-3〕。云南山楂在云南等地作中药山楂药用，其有野生种和栽培种之分。周庆平等〔4〕发现云南山楂果实具有较强的体外清除超氧阴离子自由基作用和体内降脂作用。目前，仅斯建勇等〔5-6〕对云南山楂的果实和叶进行了化学成分研究，报道了10个常见的黄酮类、三萜类化学成分。为充分利用云南山楂资源，本文对采自云南大理苍山的野生云南山楂（野生种）果实的化学成分及其体外降脂活性进行了初步研究，结果从该植物果实95%乙醇提取物中分离得到6个化合物，分别鉴定为苯甲酸（1）、2-羟基丁二酸二甲酯（2）、2-羟基丁二酸-1-甲基酯（3）、β-谷甾醇（4）、胡萝卜苷（5）、槲皮素（6），其中化合物2和3为首次从山楂属植物中分离得到，化合物1为首次从该植物中分离得到。见图1。

图1 化合物1~6的结构式

1 仪器与材料

AvanceⅢ-400核磁共振波谱仪（德国布鲁克公司），四甲基硅烷（TMS）为内标；SGW-3自动旋光仪（上海仪电物理光学仪器有限公司）；Buchi R-210旋转蒸发仪（瑞士步琦公司）；柱层层析硅胶（青岛海洋化工厂分厂）；薄层层析硅胶板GF254（青岛海洋化工有限公司）；Sephadex LH-20（瑞典安发玛西亚生物技术公司）；D101大孔吸附树脂（天津波鸿树脂科技有限公司）；石油醚、乙酸乙酯、氯仿、丙酮、甲醇均为工业纯，经重蒸后使用。

本实验所用植物样品于2018年10月采自云南大理苍山，经大理大学药学院张德全教授鉴定为云南山楂［Crataegus scabrifolia（Franch.）Rehd.］野生种的果实，植物标本（编号20181009-2）保存于大理大学药物研究所。

2 方法

2.1 植物提取野生云南山楂果实6.4 kg，粉碎后，95%乙醇冷浸提取4次，冷浸液经减压浓缩后得到总浸膏2.7 kg，提取率为42.2%。

2.2 化合物分离野生云南山楂果实总浸膏（2.7kg）以2.7 kg 80~100目硅胶吸附后经200~300目硅胶柱层析，氯仿-丙酮（1：0→0：1）溶剂系统梯度洗脱，最后用甲醇洗脱，薄层色谱法（TLC）检测合并相同流分，得到8个组分（Fr.1~Fr.8）。Fr.2组分（25 g）经硅胶柱色谱（石油醚-乙酸乙酯60：1→2：1），得到11个组分（Fr.2-1~Fr.2-11）。Fr.2-6放置后有晶体析出，经石油醚反复洗涤，得到化合物4（1.65 g）。Fr.3组分（80 g）经硅胶柱色谱（石油醚-丙酮15：1→0：1），得到11个组分（Fr.3-1～Fr.3-11）。Fr.3-5经反复硅胶柱色谱（石油醚-丙酮15：1→0：1）和Sephadex LH-20凝胶柱色谱（氯仿-甲醇1：1），得到化合物1（30 mg）。Fr.3-8经反复硅胶柱色谱（石油醚-丙酮15：1→0：1、氯仿-乙酸乙酯20：1→4：1）和Sephadex LH-20凝胶柱色谱（氯仿-甲醇1：1），依次得到化合物2（66 mg）和3（144 mg）。Fr.5组分（62 g）经D101大孔吸附树脂（甲醇-水0：1→1：0）反相梯度洗脱，得到5个组分（Fr.5-1～Fr.5-5）。Fr.5-2经硅胶柱色谱（氯仿-丙酮30：1）和Sephadex LH-20凝胶柱色谱（氯仿-甲醇1：1），得到化合物6（8 mg）。Fr.5-4放置后有沉淀析出，以甲醇反复洗涤得到化合物5（3.13 g）。

2.3 体外降脂活性测试参照文献〔7〕中的方法，并进行适当改良，具体如下：将HepG2细胞（1.5×104个∕孔）接种于96孔板上，置37℃和5%CO2环境下培养至细胞丰度达90%以上时，以0.6 mmol∕L的油酸钠和0.3 mmol∕L的棕榈酸钠诱导。24 h后，供试组每孔加入20µL供试化合物溶液，空白组和模型组每孔加入20µL相应溶媒。继续培养24 h后，小心移除孔内培养液，每孔加入60µL 10%甲醛溶液固定30 min。随后移除固定液，每孔加入60µL 0.4 mg∕mL油红O工作液染色，60 min后用磷酸盐缓冲溶液（PBS）冲洗3遍，置倒置显微镜下观察细胞内脂滴染色情况。最后每孔加入200µL异丙醇，并用酶标仪测定波长510 nm下各组的OD值。降脂率按以下公式计算：降脂率=［1-（供试组OD值-空白组OD值）∕（模型组OD值-空白组OD值）］×100%。

3 结果

3.1 化学成分化合物1：白色针晶（氯仿）。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：8.15（2H，brd，J=7.6 Hz，H-2，6），7.63（1H，brt，J=7.6 Hz，H-4），7.49（2H，brt，J=7.6 Hz，H-3，5）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：172.7（s，-COOH），129.5（s，C-1），130.3（d，C-2，6），128.6（d，C-3，5），134.0（d，C-4）。以上数据与文献〔8〕报道基本一致，故鉴定该化合物为苯甲酸。

化合物2：白色固体。[α]25D=0（c=0.10，MeOH）；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：4.51（1H，dd，J=6.6，4.8 Hz，H-2），3.75（3H，s，4-OCH3），3.68（3H，s，1-OCH3），2.81（1H，dd，J=16.1，4.8 Hz，H-3a），2.72（1H，dd，J=16.1，6.6 Hz，H-3b）；13C-NMR（100MHz，CD3OD）δ：173.6（s，C-1），67.0（d，C-2），38.5（t，C-3），171.2（s，C-4），52.1（q，4-OCH3），51.6（q，1-OCH3）。以上数据与文献〔9〕报道基本一致，故鉴定该化合物为2-羟基丁二酸二甲酯。

化合物3：无色针晶（丙酮）。[α]25D=0（c=0.10，MeOH）；1H-NMR（400 MHz，CD3COCD3）δ：4.51（1H，dd，J=7.1，4.7 Hz，H-2），3.69（3H，s，-OCH3），2.79（1H，dd，J=16.2，4.7Hz，H-3b），2.66（1H，dd，J=16.2，7.1 Hz，H-3a）；13C-NMR（100 MHz，CD3COCD3）δ：174.2（s，C-1），68.2（d，C-2），39.3（t，C-3），172.1（s，C-4），52.3（q，-OCH3）。以上数据与文献〔9〕报道基本一致，故鉴定该化合物为2-羟基丁二酸-1-甲基酯。

化合物4：无色针晶（氯仿）。1H-NMR（400 MHz，CDCl3-CD3OD）δ：5.34（1H，brs，H-6），3.45（1H，m，H-3），1.02（3H，s，Me-19），0.94（3H，d，J=6.5 Hz，Me-21），0.86，0.84，0.82（each 3H，overlap，Me-26，27，29），0.70（3H，s，Me-18）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3-CD3OH）δ：36.9（t，C-1），30.7（t，C-2），70.8（d，C-3），41.4（t，C-4），140.5（s，C-5），121.1（d，C-6），31.5（t，C-7），31.5（d，C-8），49.9（d，C-9），36.1（s，C-10），20.7（t，C-11），39.4（t，C-12），41.9（s，C-13），55.7（d，C-14），23.9（t，C-15），27.8（t，C-16），56.4（d，C-17），11.3（q，C-18），18.8（q，C-19），35.8（d，C-20），18.2（q，C-21），33.5（t，C-22），25.6（t，C-23），45.5（d，C-24），28.7（d，C-25），19.2（q，C-26），18.4（q，C-27），22.6（t，C-28），11.3（q，C-29）。以上数据与文献〔10〕报道基本一致，故鉴定该化合物为β-谷甾醇。

化合物5：白色粉末。在TLC上用多种溶剂系统展开后化合物5与已鉴定化合物胡萝卜苷Rf值及斑点颜色均一致，故鉴定该化合物为胡萝卜苷。

化合物6：黄色粉末。1H-NMR（400 MHz，CD3COCD3）δ：12.20（1H，s，5-OH），7.83（1H，d，J=2.1 Hz，H-2'），7.71（1H，dd，J=8.5，2.1 Hz，H-6'），7.01（1H，d，J=8.5 Hz，H-5'），6.54（1H，d，J=2.0 Hz，H-8），6.27（1H，d，J=2.0 Hz，H-6）。以上数据与文献〔11〕报道基本一致，故鉴定该化合物为槲皮素。

3.2 体外降脂活性体外高脂HepG2细胞模型降脂实验结果表明，化合物2～5在200µmol∕L浓度下均未有明显的降脂率，无体外降脂活性。