云南省保山市健康人群脑膜炎奈瑟菌带菌状况调查

陈晨，任远，郭妮，郑月，李育中，唐聪，谭银珍，李娇春，王学付，寸韡，毕研伟

1.中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所，云南昆明650031；

2.保山中医药高等专科学校，云南保山678000

脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis，Nm）是引起流行性脑脊髓膜炎（简称流脑）的病原菌［1］。该病多发于儿童，人群隐性感染多，发病率、病死率均较高。Nm可分为13个血清群，能引起侵袭性流脑的菌株多具有完整的荚膜结构，包括A、B、C、Y、W135和X群［2］。无症状带菌者是该病的主要传染源，健康人群带菌情况与流脑疫情趋势呈现一定的相关性［3］。

保山市位于云南省西南部，处于滇西居中，是中国通往南亚、东南亚乃至欧洲各国的必经之地，其西北、正南部与缅甸交界，而缅甸等部分东南亚国家尚未将流脑疫苗列为国家常规接种疫苗，随着边境地区人员迁徙与流动，时有从缅甸输入流脑病例的报道［4］。保山市近年来脑膜炎奈瑟菌流行病学调查数据缺乏，因此，本研究选择保山市作为调查区域。

青年人群由于升学更易出现来自不同地区人员的学校聚集，这使得青年人群成为流脑暴发高危人群，而在中国，流脑疫苗主要针对的接种对象为婴幼儿及3岁或6岁儿童，本研究选择在18～22岁健康人群中调查脑膜炎奈瑟菌携带状况，可为中国青年人接种流脑疫苗提供参考，为今后流脑疫情监测提供依据。

1 材料与方法

1.1 样本来源 本次调查选择保山市隆阳区一高校作为调查点，采用随机抽样的方法，于2020年12月随机抽取1 076名18～22岁且处于健康状态的学生采集咽拭子样本，共采集样本1 076份。

1.2 参考菌株Nm标准菌株共5株，分别为A、B、C、W135、Y群，由中国医学科学院医学生物学研究所保存。

1.3 主要试剂 巧克力双抗平板（含3.3μg／mL盐酸万古霉素和4.2μg／mL硫酸多黏菌素）培养基购自广东环凯微生物科技有限公司（货号：J0612Y）；Taq DNA聚合酶等购自康为世纪生物科技有限公司（货号：CW0655M）。

1.4 采样及培养 受试者签署知情同意书后采集咽拭子标本，立即接种于巧克力双抗平板，37℃，5%CO2条件下培养24～48 h。

1.5 分离鉴定 挑取圆形，光滑，湿润，中央凸起，边界清晰，无色或灰色，不透明的菌落，转接于新的巧克力双抗平板，再次培养24 h，同时将标准菌株（B群）平板划线，在相同条件下培养作为阳性对照；挑取菌落，溶解至1 mL PBS（pH 7.4）中，制备为菌悬液，取少量菌悬液，滴加至载玻片上进行革兰染色，取B群标准菌株平板上菌落作为阳性对照，双球形的菌株进行PCR鉴定和分群。

1.6 PCR鉴定和分群 挑取单菌落为模板进行PCR检测。首先对流脑通用基因荚膜转运基因（crgA）和铜-锌超氧化物歧化酶基因（sodC）进行扩增，确定为Nm阳性菌落；再对各血清群特异性基因进行扩增，以确定血清群。扩增体系为：2×taq DNA聚合酶预混液5μL，引物（10μmol／L）各0.2μL，模板0.2μL，无菌水加至10μL。以标准菌株（B群）的crgA和sodC基因作为阳性对照，无菌水作为阴性对照。反应条件：95℃10 min；95℃30 s，56℃30 s，72℃1 min，共29个循环；最后72℃延伸5 min。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列、靶基因及扩增片段长度见表1［5］。

1.7 统计学分析 采用Excel软件对检测数据进行录入整理，计算带菌率，分析各血清群分布情况。

表1 引物序列、靶基因及扩增片段长度Tab.1 Primer sequence，target gene and lengths of amplified fragments

2 结果

2.1Nm菌株的分离鉴定 咽拭子样本接种于巧克力双抗平板后培养24～48 h，Nm阳性菌株可生长为湿润，略带灰色半透明的圆形菌落，见图1。挑取单菌落进行革兰染色镜检，可鉴定为红色，双球形的革兰阴性菌，见图2。

图1 咽拭子样本涂板后培养24 hFig.1 Pharyngeal swab samples spread and cultured for 24 h

图2 细菌培养后经革兰染色镜检（×100）Fig.2 Microscopy of bacterial culture after Gram staining（×100）

2.2 血清学分群PCR检测结果显示，Nm阳性菌株可见crgA和sodC基因条带，见图3。阳性菌株经血清学分群，A群可见400 bp的orf-2基因条带，B群可见180 bp的synD基因条带，C、Y、W135群分别可见250、120和120 bp的siaD基因条带，X群可见120 bp的ctrA基因条带，见图4。

2.3 调查结果1 076份咽拭子样本中，经细菌培养和PCR检测共鉴定出Nm阳性样本17份，带菌率为1.58%，其中B群菌株14份，C群菌株2份，X群菌株1份。

图3 Nm crgA（A）和sodC（B）基因的PCR产物电泳图Fig.3 Electrophoretic profile of PCR products of Nm crgA（A）and sodC（B）genes

图4 Nm特异性分群基因PCR产物电泳图Fig.4 Electrophoretic profile of PCR products of Nm specific clustering genes

3 讨论

Nm所导致的流脑是一种急性的呼吸道感染疾病，临床诊断通常以出现发热、呕吐、头痛为依据，该病多发于儿童，起病急，人群隐性感染多，发病率和病死率均较高。对于健康人群流脑的携带情况进行调查，可有效监测流脑的流行趋势，及时采取措施，有效预防流脑疫情发生。目前对流脑的实验室检测方法较多，包括细菌分离培养、免疫学检测、普通PCR检测、Real-time PCR检测等。PCR是一种较常用的检测方法，具有灵敏度较高，检测快速，准确的优点，前期通过对于实验方法的探索，证实PCR法对于流脑检出的灵敏度可达1 copy／mL。其中细菌分离培养的方法虽繁琐且耗时长，咽拭子标本若不及时涂板，易导致标本失效，但这种方法可通过平板扩增，使菌种得以保留，为后续流脑疫苗的进一步研究提供材料。由于正常人群口腔中有葡萄球菌、链球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌等几百种细菌类型，咽拭子接种于抗性巧克力平板，平板上生长的菌群类型相较于无抗性的平板更单一，更有利于筛选出Nm，因此，本研究采用了含双抗的巧克力平板，提高了检出概率。同时，联合PCR法准确确定了样本中携带的Nm的血清型。crgA和sodC基因是Nm保守的调控基因，可用于阳性菌株的鉴别，但不能用于血清学分群。编码唾液酸转移酶的siaD基因对于不同血清群的Nm具有特异性，因此可用于NmB、C、Y、W135等血清群的分群，A群Nm的荚膜多糖不是唾液酸，因此对于A群Nm荚膜表达基因的第2个ORF序列进行扩增，可特异性地检出A群Nm。

中国曾在1959、1967、1977和1985年发生了4次流脑大流行［2］，1980年以来，A群流脑多糖疫苗开始在我国接种，使得流脑暴发率显著降低，自2008年《扩大免疫规划实施方案》实施，流脑疫苗作为免费一类疫苗，接种人群大幅增加，但2008年以前出生的人群大多无流脑疫苗免疫史，有必要对这类人群进行流脑带菌率调查，有效预测流脑传播和暴发趋势。本次调查结果显示，保山市18～22岁健康人群中Nm携带率为1.58%，与新疆等中国其他地区报道的调查数据相比［6］，保山市健康青年人群Nm携带率处于较低水平。

中国历史上流行的流脑菌株以A群为主［6］，由于A群和A+C群Nm疫苗的广泛使用，A、C群流脑病例呈持续下降趋势，由于B群流脑疫苗尚未广泛接种，目前中国流脑血清群分布以B群为主［7］。云南省近年来在健康人群中发现的Nm菌群有A、B、C群，人群抗体水平不高，对流脑的免疫力较弱［8］。在本次调查中，B群在Nm阳性样本中所占比例最高，C群次之，未发现A群Nm阳性样本，这与文献报道一致［7］。另外，本次调查发现1例X群阳性样本，这是首次在云南省健康人群中分离出X群流脑菌株。X群Nm自20世纪90年代以来在非洲流行［9-10］，中国少有X群Nm的报道［11］，此次分离出X群阳性菌株，表明X群Nm在中国西南地区已出现，因此，关注流脑菌群变迁，加强监测，及按计划接种流脑疫苗仍今后流脑防控工作的关键。