结核分枝杆菌早期分泌蛋白MPT64的原核表达及其在结核病血清学诊断上的初步应用

屈蓉，吴康，吴娟，范小勇，吕建新

1.温州医科大学检验医学院、生命科学学院，浙江 温州325035；

2.上海市（复旦大学附属）公共卫生临床中心，上海201508

结核病（tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）感染引起的以呼吸系统受累为主的传染病。2018年，全球新增约1 000万TB病例，其中约145万患者死亡，TB是全球单一感染病原菌所致疾病中致死人数最多的疾病［1］。因此，早期且快速诊断和及时有效治疗是消除传染源、控制TB的关键。

目前，TB诊断的主要方法有胸部X线检查、细菌学检测（痰涂片抗酸染色和细菌学培养法）、PPD皮肤试验（tuberculin skin test，TST）及核酸扩增分子生物学检测等综合方法。细菌培养是TB诊断的金标准，但检测周期长，仅靠其判断会影响患者的及时治疗［2］。PPD皮试是一种临床常用的免疫学皮试检测方法，操作简单、耗时短，但无法明确区分卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin，BCG）免疫、环境NTM（nontuberculosis mycobacteria）感染和致病性Mtb感染，鉴别诊断价值不高，且影响因素较多，易出现较高的假阳性和假阴性结果［3］。以Gene-Xpert为代表的核酸扩增技术在早期诊断中发挥日益重要的作用，正成为TB病原学诊断方法的一种重要补充，但其成本和对检测环境的严格要求限制了其在基层医院的广泛使用［4］。因此，寻找灵敏度和特异性俱佳的Mtb抗原并将其运用至血清学检测，仍是TB早期检测及其鉴别诊断的一个重要手段。

MPT64存在于Mtb活跃复制的细菌细胞中，在培养初期大量分泌，随着培养时间的延长而减少［5］。MPT64不存在于弱毒性的BCG菌株中，提示其可能是Mtb毒力相关因子。MPT64参与机体与免疫系统的相互作用［6-7］，可诱导抗原特异性T细胞免疫反应，有可能作为诊断活动性结核的标志物［8］。本研究原核表达、纯化了重组MPT64蛋白，并初步探讨了其在TB血清学诊断中的价值。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒及蛋白 大肠埃希菌克隆菌株Top10及表达菌株BL21（DE3）、原核表达载体pET28a（+）、Mtb标准株H37Rv基因组、重组GroES蛋白、重组Ag85A蛋白均由上海市公共卫生临床中心结核病感染与免疫课题组保存。

1.2 血清样本44份患者血清由上海市公共卫生临床中心于2020年1—8月收集，均为经临床表现及X线检查或细菌学检查、病理组织学检查等确诊为TB的病例，设为TB组。健康对照组［HC（healthy control）组］血清收集自该中心的36名体检健康人群，均无TB密切接触史，无临床症状，胸片检查无异常表现。

1.3 主要试剂及仪器 限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、T4 DNA连接酶、Pfu DNA Polymerase和低相对分子质量蛋白标准均购自立陶宛MBI Fermentas公司；HRP标记的鼠抗人IgA和HRP标记的山羊抗兔IgG为北京博奥龙生物技术公司产品；HRP标记的山羊抗人IgG抗体为美国BETHYL公司产品；亲和层析所用介质Ni-NTA Sepharose（Ni2+-NTA亲和柱）为美国GE Healthcare公司产品；Protein G柱购自中科森辉微球技术（苏州）有限公司。

1.4 实验动物SPF级新西兰大白兔，雌性，8周龄，体重2 kg，购自上海甲干生物技术有限责任公司，动物合格证号为：20150005004191。

1.5mpt64基因的扩增 根据GenBank中登录的mpt64基因序列（AY208674）设计引物，上游引物F：5′-CGCGGATCCATGCGCCCAAGACCTACTGCGAG-3′（下划线部分为BamHⅠ酶切位点），下游引物R：5′-CCGGAATTCCTAGGCCAGCATCGAGTCGA-3′（下划线部分为EcoRⅠ酶切位点），扩增片段大小为687 bp。以H37Rv基因组DNA为模板，PCR扩增mpt64基因。反应条件：98℃预变性1 min；98℃15 s，58℃15 s，68℃30 s，共30个循环；68℃延伸7 min。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.6 重组表达质粒的构建 用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切扩增产物及pET28a（+）质粒，胶回收酶切产物，载体与mpt64基因片段连接，连接产物转化E.coliTop10感受态细胞，挑选阳性单克隆，抽提质粒，经双酶切（BamHⅠ／EcoRⅠ）鉴定正确后，送苏州金唯智生物科技有限公司测序，鉴定正确质粒命名为pET28a-mpt64。

1.7 重组MPT64蛋白的诱导表达 将重组表达质粒pET28a-mpt64转化大肠埃希菌BL21（DE3），挑取阳性单克隆接种于含50μg／mL卡那霉素的LB培养基中，37℃培养过夜；再以2%比例转种至200 mL LB培养基中，振荡培养至A600约0.6～0.8时，加入终浓度为1.0 mmol／L的IPTG，37℃诱导过夜；8 000×g离心10 min，收获菌体，PBS重悬，超声碎菌，收集全菌裂解液、离心后的上清和沉淀，进行12%SDS-PAGE分析。

1.8 重组MPT64蛋白的纯化 将重组菌大量培养、诱导表达并超声破碎，离心后收集上清，经Ni2+-NTA亲和柱纯化。用不同咪唑浓度（25、50、100、150、250和500 mmol／L）的洗脱液（含50 mmol／L Tris-HCl，100 mmol／L NaCl）逐步洗脱，收集洗脱液，12%SDS-PAGE分析。收集纯度较高的几管洗脱液，透析除去盐类及咪唑，BCA测定浓度，1 mL／管分装保存。

1.9 MPT64兔多克隆抗血清的制备 将纯化的MPT64蛋白600μg与弗氏完全佐剂1∶1混合，皮下多点免疫新西兰大白兔，隔周免疫1次，共4次。第2、4、6周与弗氏不完全佐剂1∶1混合加强免疫，2周后，耳缘静脉采血，分离血清，-80℃保存。间接ELISA法检测效价：用2μg／mL MPT64蛋白包被ELISA板，4℃孵育过夜；3% BSA-PBS室温封闭1 h；加入血清［PBS 10倍系列稀释（102～106）］，室温2 h；加入HRP标记的山羊抗兔IgG（1∶5 000稀释），室温孵育30 min；TMB显色。免疫4次后，动脉取血，经Protein G柱纯化兔多克隆抗血清。

1.10 重组MPT64蛋白的抗原特异性鉴定 采用Western blot法。将纯化的重组蛋白经12% SDSPAGE分离后，半干转至PVDF膜上，经5%脱脂奶粉室温封闭2 h；加入重组MPT64蛋白兔多克隆抗血清（1∶5 000稀释），4℃孵育1 h；TBST缓冲液（含1×TBS，0.05% Tween 20）洗涤，加入HRP标记的山羊抗兔IgG（1∶5 000稀释），室温孵育1 h；TBST洗涤，ECL显影。

1.11 抗原的血清学评价 采用间接ELISA法测定TB组44份和HC组36份血清中抗MtbIgG或IgA抗体水平。分别以5μg／mL MPT64、GroES和Ag-85A蛋白包被ELISA板，100μL／孔，4℃包被过夜；3% BSA-PBS封闭，加入MPT64兔多克隆抗血清（PBS 1∶2 000稀释），100μL／孔，室温2 h；加入HRP标记的羊抗人IgG（1∶20 000稀释）或HRP标记的鼠抗人IgA（1∶5 000稀释），室温孵育30 min；加入TMB，室温显色5 min；酶标仪测定450 nm波长处A值。

1.12 统计学分析 采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1mpt64基因扩增产物的鉴定mpt64基因PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见687 bp的特异性条带，大小与预期一致，见图1。

图1 mpt64基因PCR产物电泳图Fig.1 Electrophoretic profile of PCR product of mpt64 gene

2.2 重组表达质粒的鉴定 重组表达质粒pET28ampt64的双酶切（BamHⅠ／EcoRⅠ）产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见687 bp的目的基因条带，见图2。测序证实，碱基序列与MtbH37Rv基因完全一致，表明mpt64基因片段已正确插入表达载体pET28a（+）中。

2.3 表达及纯化产物的鉴定12%SDS-PAGE分析显示，表达的重组MPT64蛋白相对分子质量约24 000，主要以包涵体形式存在，部分以可溶性形式存在；经Ni2+-NTA亲和柱纯化后，纯度可达90%，蛋白浓度约2.0mg／mL。见图3。

2.4 重组MPT64蛋白的免疫原性及抗原特异性ELISA结果显示，MPT64兔多克隆抗血清效价可高达1∶2 048 000，表明该重组蛋白具有良好的免疫原性。Western blot分析显示，纯化的MPT64蛋白可与兔多克隆抗血清反应，在相对分子质量约24 000处可见特异性条带，见图4，表明该重组蛋白具有良好的抗原特异性。

2.5 MPT64抗原检测临床血清的评价ELISA结果表明，TB组血清中的MPT64抗原特异性IgG、IgA抗体水平均显著高于HC组，差异有统计学意义（t分别为5.272和2.130，P均<0.05）；而GroES和Ag85A抗原特异性IgG、IgA抗体水平两组之间差异无统计学意义（tGroES分别为1.394和0.920 2，tAg85A分别为0.236 6和1.690；P均>0.05）。见图5。

图2 重组表达质粒pET28a-mpt64的双酶切（BamHⅠ／EcoRⅠ）鉴定Fig.2 Restriction map of recombinant plasmid pET28ampt64（BamHⅠ／EcoRⅠ）

图3 表达及纯化的重组MPT64蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE profile of expressed and purified recombinant MPT64

图4 重组MPT64蛋白的Western blot分析Fig.4 Western blotting of recombinant MPT64

图5 ELISA法检测受试者血清中的IgG和IgA抗体水平Fig.5 Determination of serum IgA and IgG levels in two groups by ELISA

3 讨论

MPT64是Mtb生长早期分泌的蛋白，由Rv1980c基因编码，包含228个氨基酸，相对分子质量约24 000。MPT64是一种仅由毒性分枝杆菌分泌的特殊蛋白，抗原特异性极强，能被CD4+T细胞、CD8+T细胞识别，并能刺激TB感染者机体产生IFNγ，对早期感染Mtb具有保护作用［9-10］，可作为TB的血清学诊断标志物。GroES是Mtb分泌至体外的一种热休克蛋白，是分枝杆菌体外培养时分泌最多的蛋白之一，可诱导较强的T细胞和B细胞免疫［11-12］。Ag85A是Mtb和BCG培养滤液中分泌蛋白的主要组成部分，可诱导T细胞增殖和IFNγ产生［13］。

血清学检测具有微创性、操作简易、适用于肺外结核和肺结核等优点。CHEN等［14］进行Rv2026c和Rv2421c多抗原的血清学检测，发现其Mtb检测的敏感性和特异性分别为82.5%和88.12%。PUKAZHVANTHEN等［15］测定4种不同抗原的血清抗体水平，发现单个抗原检测时敏感性为20%～52.5%，特异性95%，但联合4种抗原检测时，灵敏度升至75%，特异性降至88%。本文以GroES和Ag85A蛋白作为对照抗原，对重组MPT64蛋白在TB组和HC组血清中的IgG和IgA抗体水平进行了初步研究。结果发现，TB组血清中MPT64抗原特异性IgG和IgA水平均显著高于HC组（P＜0.05），而两组间GroES、Ag85A抗原特异性IgA和IgG水平差异则无统计学意义（P＞0.05）；当特异性固定为83%时，通过MPT64特异性IgG检测可检出55%的TB患者，而通过GroES或Ag85A特异性IgG检测则仅可检出41%或25%的TB患者。综上所述，MPT64具有较好的TB检出能力，可作为TB血清学诊断的备选抗原之一。如将MPT64与其他Mtb特异性抗原联合使用进行血清学诊断，有望进一步提高TB早期诊断的灵敏度。