新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）特异性分析

2021-05-19董江锴杜金凤程天龄黄迎燕夏小凯邹勇张云涛杨晓明

中国生物制品学杂志 2021年5期

董江锴，杜金凤，程天龄，黄迎燕，夏小凯，邹勇，张云涛，杨晓明，4

1.上海捷诺生物科技有限公司，上海201700；2.长春生物制品研究所有限责任公司，吉林长春130012；3.中国生物技术股份有限公司，北京100029；4.国家联合疫苗工程技术研究中心武汉生物制品研究所有限责任公司，湖北武汉430207

自2019年12月以来，由2019新型冠状病毒（2019 novel corona virus，2019-nCoV）感染引起的新型冠状病毒肺炎迅速在全球暴发蔓延。2020年2月11日，世界卫生组织代表在新型冠状病毒全球研究与创新论坛上，将2019-nCoV正式命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2），由SARS-CoV-2引起的新型冠状病毒肺炎正式命名为COVID-19（coronavirus disease 2019）［1］。在我国，COVID-19作为急性呼吸道传染病已纳入《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病，按甲类传染病管理［2］。SARSCoV-2属于冠状病毒β属，其基因结构特征与SARSCoV和中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）有明显区别［3-4］。临床上COVID-19以发热、乏力、干咳为主要表现；胸部影像学以双肺多发磨玻璃阴影为主要特征［5-6］。自该病暴发初期，国家卫生健康委员会及时发布了《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》及《新型冠状病毒感染的肺炎防控方案》，用于规范指导临床和疾控机构对COVID-19的诊疗，并随着对病原及疾病认识的不断深入而不断更新［7-8］。

在呼吸系统标本中检出SARS-CoV-2病原体是诊断COVID-19的金标准。国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南》中，及时公布了基于荧光PCR法，检测病毒核酸ORF1ab和N基因的引物和探针序列，指导生产企业用于SARS-CoV-2核酸检测试剂的开发［9］。临床上引起呼吸系统疾病的病原体非常复杂，可由单一病原体引起单纯感染或多种病原体引起的混合感染，其临床症状如发热、乏力、干咳、鼻塞等非常相似［10］，干扰临床精准诊断和治疗；此外，临床用药对部分辅助性检测方法也会产生非特异性干扰，因此，样本采集过程中必然受到各种内源性和外源性干扰物质的影响。鉴于COVID-19高传染性的特点，临床和疾控部门对COVID-19诊断筛查过程中核酸检测试剂的高特异性要求显得尤为重要。虽然目前可应用于临床诊断的核酸检测方法和试剂不断更新，但由于荧光PCR法便捷、敏感、稳定，仍是应用最广泛的核酸检测方法。上海捷诺生物科技有限公司生产的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法），经过不断的条件优化及各项性能验证，在临床诊断、流行病学筛查、疾病预后等的应用过程中，进行了充分的数据检验，本文对该公司连续生产的3批核酸检测试剂盒的特异性进行评估，以保证试剂盒在样本存在干扰的情况下仍能准确判定样本。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器连续生产的3批新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法），批号：COV001NP、COV002NP和COV003NP，由上海捷诺生物科技有限公司生产；核酸提取试剂盒（货号：52904）为德国QIAGEN公司产品；一次性使用病毒采样管购自深圳梓健生物科技有限公司（粤深械备20190041号）；ABI7500实时荧光PCR仪购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 病毒及致病细菌核酸或病原体地方性人冠状病毒（HKU1、OC43、NL63和229E）核酸，SARS-CoV核酸，MERS-CoV核酸，HIN1［新型甲型H1N1流感病毒（2009）、季节性H1N1流感病毒］、H3N2、H5N1、H7N9病毒核酸，乙型流感Yamagata、Victoria，呼吸道合胞病毒A、B型病毒核酸，副流感病毒1、2、3型，鼻病毒A、B、C，腺病毒1、2、3、4、5、7、55型，肠病毒A、B、C、D，人间质肺病毒，EB病毒核酸，麻疹病毒，人巨细胞病毒，轮状病毒，诺如病毒，腮腺炎病毒，水痘-带状疱疹病毒，肺炎支原体，肺炎衣原体，军团菌，百日咳杆菌，流感嗜血杆菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌，化脓性链球菌，肺炎克雷伯菌，结核分枝杆菌，烟曲霉，白色念珠菌，光滑念珠菌，新生隐球菌，均购自中国食品药品检定研究院。

1.3 人基因组DNA由上海捷诺生物科技有限公司在符合生物伦理要求情况下采集正常人口腔上皮脱落细胞制备并保存。

1.4 干扰物质按照国家食品药品监督管理局医疗器械技术审评中心发布的《2019新型冠状病毒核酸检测试剂注册技术审评要点》要求，选取人黏蛋白、血液（人）、苯福林、羟甲唑啉、氯化钠（含防腐剂）、倍氯美松、地塞米松、氟尼缩松、曲安奈德、布地奈德、莫米松、氟替卡松、盐酸组胺、ɑ-干扰素、扎那米韦、利巴韦林、奥司他韦、帕拉米韦、洛匹那韦、利托那韦、莫匹罗星、妥布霉素、左氧氟沙星、阿奇霉素、头孢吡肟、米诺环素、阿比多尔、头孢曲松和美罗培南为干扰物质，均购自国家标准物质资源平台。

1.5 阳性样本核酸、临界阳性样本核酸及阴性样本核酸均来源于临床试验过程中临床诊断为COVID-19阳性和阴性患者鼻咽拭子提取物，样本采集过程严格遵守临床实验室关于SARS-CoV-2诊断安全防护要求，由上海捷诺生物科技有限公司保存。

1.6 验证方法

1.6.1 阳性样本核酸、临界阳性样本核酸及阴性样本核酸的提取采用核酸提取试剂盒提取核酸，提取过程严格遵守临床实验室关于SARS-CoV-2诊断安全防护要求。SARS-CoV-2核酸定量由生工生物工程（上海）股份有限公司采用微滴数字PCR法进行，然后配制阳性核酸样本为10 000 copies／mL，临界阳性核酸样本为600 copies／mL。

1.6.2 交叉反应性验证将以上病原体核酸分为18组，按不同病原体医学相关水平（细菌感染浓度约106cfu／mL，病毒约105cfu／mL）分别加至阳性样本核酸、阴性样本核酸中，按照病原体组号，将混合阳性样本命名为P1～P18，混合阴性样本命名为N1～N18，同时设阳性和阴性空白对照（P0和N0）。使用3批（COV001NP、COV002NP和COV003NP）试剂盒，每份样本重复3次，记录Ct值。代表相应核酸的呼吸道病原体分组见表1。

1.6.3 抗干扰物质验证将以下29种干扰物质按临床常见最高浓度加至阳性样本（分别命名为P1～P29）、临界阳性样本（分别命名为LP1～LP29）、阴性样本（分别命名为N1～N29），设阳性、临界阳性及阴性空白对照（分别命名为P0、LP0和N0）。使用3批试剂盒（COV001NP、COV002NP和COV003NP），每份样本重复3次，记录Ct值。干扰物质及使用浓度见表2。

1.6.4 检测方法及判定标准样品检测方法严格按试剂盒说明书进行。每个反应程序设阴性质控、阳性质控及内控各3孔。PCR反应体系25μL。PCR反应条件：逆转录50℃5 min；预变性95℃20 s；95℃10 s，57℃60 s，共45个循环。ORF1ab／N Ct值＜37为阳性，ORF1ab／N Ct值≥37为阴性。

表1 呼吸道常见病原体分组Tab.1 Grouping of common pathogens of respiratory tract

表2 干扰物质及使用浓度Tab.2 Concentration of interfering substances

2 结果

2.1 交叉反应性3批试剂盒检测结果显示，P0～P 18检测结果均为阳性，见表3，N0～N18检测结果均为阴性。表明以上交叉反应物质对试验结果无影响。

2.2 抗干扰性能3批试剂盒检测结果显示，P0～P29、LP0～LP29检测结果均为阳性，见表4和表5，N0～N29检测结果均为阴性。表明29种内源／外源干扰物质对3批试剂盒的检测结果无影响。

表3 COV001NP、COV002NP、COV003NP批试剂盒检测混合阳性样本ORF1ab／N Ct值（，n=3）Tab.3 Test results of ORF1ab／N Ct of mixed positive samples by detection kits of Lots COV001NP，COV002NP and COV003NP（，n=3）

表4 COV001NP、COV002NP、COV003NP批试剂盒检测阳性样本ORF1ab／N Ct值（，n=3）Tab.4 Test results of ORF1ab／N Ct of positive samples by detection kits of Lots COV001NP，COV002NP and COV003NP（，n=3）

表5 COV001NP、COV002NP、COV003NP批试剂盒检测临界阳性样本ORF1ab／N Ct值（，n=3）Tab.5 Test results of ORF1ab／N Ct of borderline positive samples by detection kits of Lots COV001NP，COV002NP and COV-003NP（，n=3）

3 讨论

自COVID-19暴发以来，作为疾病诊断金标准的核酸定性检测荧光PCR法快速研发上市，成为临床确诊筛查的主要手段。荧光PCR法因其敏感度高，特异性强，已被广泛应用于疾病诊断、鉴别诊断、疗效评估及流行病学调查，是临床微生物检测最常用的分子生物学检测手段［11-12］。在呼吸系统感染疾病诊断中，由于感染病原微生物复杂程度高，且荧光PCR法高敏感性的特点，使病原核酸检测过程和结果极易受到污染及干扰，新建立的核酸检测方法以及试剂的检测特异性和良好的抗干扰能力是适用于临床应用的前提。

本研究参考《2019新型冠状病毒核酸检测试剂注册技术审评要点》对地方性人冠状病毒、呼吸道常见病毒及病原菌等55种病原体，在其感染的医学相关水平进行了系统的交叉反应验证［13］。将病原体交叉分组，分别加至阳性样本和阴性样本并设置人管家基因基因组交叉样本。检测结果显示，连续生产的3批新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法），混合阳性样本及混合阴性样本特异性检测具有良好的稳定性。在抗干扰物质验证中，针对检测过程中可能存在的干扰情况，分别进行了每种干扰物质临床潜在最大浓度对阳性及临界阳性水平的阳性对照的干扰试验验证，干扰物质涵盖了样本采集过程中人自身样本污染物及27种临床常用抗病毒药物、抗菌药物及疾病治疗过程中可能用到的抗过敏等内用或外用药物。检测结果显示，连续生产的3批新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）检测阳性、临界阳性、阴性样品，具有较高的抗干扰能力和检测稳定性。以上结果表明，该试剂盒符合临床特异性检测要求［13］。

荧光PCR法核酸检测灵敏度高，检测结果易受多种内源及外源因素的影响。对于COVID-19的诊断，早期样本采集主要集中在呼吸系统样本，包括鼻咽拭子、呼吸道分泌物等，对于特殊病例，患者肛拭子等其他样本也检出SARS-CoV-2，因此除呼吸系统病原存在交叉污染的可能外，还存在多种其他已知病原体交叉污染的可能［14］。除SARS-CoV-2外，目前已发现可感染人类的冠状病毒还有6种，它们之间病毒基因结构差别不大，有些常见病毒虽不引起严重肺炎性疾病，但对核酸检测会造成干扰。另外，呼吸系统感染引起早期临床症状的相似性也是误导COVID-19临床诊断的影响因素之一［15-16］。因此，对核酸检测试剂交叉反应性评价是方法学建立和临床应用的前提。本研究使用连续生产的3批新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法），系统评估了方法的检测特异性。验证设计全面考虑了临床采样、临床用药及潜在交叉污染的微生物病原体的干扰，保证了COVID-19临床精准诊断的特异性，并为荧光PCR法核酸检测试剂的开发提供了设计思路。