抑制剂ICG001联合转化生长因子-β对四氯化碳诱导小鼠肝纤维化的治疗作用及其机制

任益凡，王晓玲，牛艳邦，李雪薇，解军，史志勇，徐钧

1.山西医科大学，山西 太原030001；2.山西医科大学第二医院普外科，山西 太原030001；3.山西医科大学生物化学与分子生物学教研室，山西太原030001；4.山西省人民医院普外科，山西太原030012；5.山西医科大学第一医院普外科山西太原030001

流行病学表明中国肝癌发病率为全球第9，因我国人口基数大，肝癌群体在全球范围内仍最多，国内人群约0.5%为肝硬化患者［1］。肝炎病毒感染是导致肝癌的主要病因，其中主要为乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）及丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染。

肝纤维化（hepatic fibrosis）是各种原因致肝损伤后的慢性修复性反应带来的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）异常堆积及合成降解失衡，为各种慢性肝病向肝硬化及肝癌发展过程中的必经阶段［2］。肝纤维化损害肝脏的结构及功能，此过程若不能抑制或逆转，会逐渐进展为肝硬化甚至肝癌，严重影响患者的生存质量。

在器官纤维化进程中，生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）发挥着关键作用［3］；在炎症方面，TGF-β也是最有效的抗炎因子［4-5］。在一项治疗肾纤维化的临床试验中证明阻断TGF-β的疗法无效，抑制TGF-β预防纤维化也将取消其保护性抗炎作用，加剧炎症，最终仍会导致纤维化［6］。由于其强大的促纤维化作用，应用TGF-β减轻炎症也无法实现。近年来，TGF-β的多效性作用一直是个难题，阻碍了TGF-β的治疗用途及靶向治疗人类疾病的作用。因此，进一步深入探索TGF-β信号通路下游的靶点将更具有选择性，可能为研究提供新的思路。

ICG001为拟肽类的小分子量物质，相对分子质量为548.631 58，是表达活性的选择性抑制剂，与βcatenin竞争表达因子结合蛋白（creb binding protein，CBP）结合部位，使复合体β-catenin／CBP形成减少，导致所在信号通路被阻断，从而操控下游靶基因的表达［7］；且ICG001对细胞膜上的β-catenin不会产生影响。目前，ICG001对信号转导的影响尚未见报道。

四氯化碳（CCl4）为常用致肝纤维化诱导剂，在国内外应用广泛。本研究采用CCl4建立小鼠肝纤维化模型［8］，在此基础上应用ICG001联合TGF-β重新定向TGF-β信号转导通路的促纤维化及TGF-β的抗炎作用，进而为ICG001联合TGF-β治疗肝纤维化的作用机制提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级C57BL／6J小鼠48只，雄性，6～8周龄，体重18～22 g，购自山西医科大学实验动物中心，许可证号：SYXK（晋）2015-0001，小鼠饲养于温度25℃，湿度40%～60%的SPF级实验动物房。

1.2 主要试剂及仪器CCl4、异丙醇、无水乙醇及氯仿均购自天津市致远化学试剂有限公司；橄榄油购自上海晶纯生化科技股份有限公司；ICG001及TGF-β购自美国MCE公司；蛋白提取试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；RNAiso Plus及TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ购自宝日医生物技术（北京）有限公司；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（Lot：00728479）购自美国Theromoscientific公司；小鼠谷丙转氨酶（ALT）ELISA试剂盒及天冬氨酸氨基转移酶（AST）ELISA试剂盒购自上海信裕生物工程有限公司；BCA蛋白定量试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司；双色预染蛋白质marker购自上海碧云天生物技术有限公司；Col-Ⅰ兔源单抗购自美国Santa Cruz公司；α-SMA及FOXO1鼠源单抗购自美国Cell Signaling Technology公司；NANODROP ONE及MiniAmp Thermal Cycler购自美国Thermo Fisher Scientific公司；StepOne Real-Time PCR System购自美国Applied Biosystems公司；ChemiDOCTM Imaging System购自美国BIO-RAD公司。

1.3 小鼠肝纤维化模型的建立及治疗48只C57BL／6J小鼠适应性饲养1周后，随机分为对照组、模型组、ICG001组及ICG001+TGF-β（IT）组，每组12只。对照组腹腔注射生理盐水，0.2 mL／只，模型组、ICG001组及IT组均腹腔注射20%CCl4，0.1 mL／只，各组连续注射6周每周2次。第5周开始治疗，对照组及模型组每日腹腔注射生理盐水，0.2 mL／只，ICG001组及IT组每日腹腔注射ICG001，0.1 mL／只，其中IT组每2日腹腔再注射TGF-β，0.1 mL／只，各组均给药2周。每日观察小鼠状态，第6周末称重并处死，眼球采血，分离血清；剖解取肝脏，生理盐水冲洗，称重，计算肝脏指数（肝脏重量占总体重的百分比），切取部分肝脏组织用甲醛固定以供包埋切片，其余-80℃保存备用。

1.4 肝脏组织切片及HE、网银染色 肝脏组织进行固定、脱水、石蜡包埋，进行连续切片。切片水化后分别进行HE及网银染色。显微镜下观察并拍照。

1.5 小鼠血清中ALT及AST含量的检测 采用ELISA法。取各组小鼠血清，按小鼠ALT ELISA试剂盒及AST ELISA试剂盒说明书，应用双抗体夹心法原理检测小鼠血清中ALT及AST的含量。步骤如下：设置标准品孔及样品孔，分别加入不同浓度的标准品及稀释后的待测样品，均50μL／孔；加入酶标试剂，100μL／孔；37℃孵育60 min；洗涤5次，每孔加显色剂A、B各50μL，混匀，37℃避光显色15 min；加终止液终止反应；用空白孔调零，波长450 nm测定各孔的吸光度值。

1.6 肝脏组织中炎症因子IL-6、IL-10、TNFα及纤维化指标FOXO1、α-SMA、Col-Ⅰ基因mRNA表达水平的检测 采用Q-PCR。取新鲜肝脏组织约100 mg，采用RNAi法提取总RNA；测定总RNA浓度及纯度；按RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit反表达试剂盒说明书配置反应体系，置MiniAmp Thermal Cycler中进行逆表达反应，反应条件：42℃30 min，72℃5 min；按SYBR Green原理配置反应体系；反应条件：94℃10 min；95℃60 s，60℃60 s，72℃60 s，共40个循环。反应完成后采用相对定量法（-△△Ct）分析。

1.7 肝脏组织中Col-Ⅰ、α-SMA及FOXO1蛋白表达水平的检测 采用Western blot。取新鲜肝脏组织约100 mg，按蛋白提取试剂盒说明书提取各组小鼠肝脏组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，8%或10% SDS-PAGE分离蛋白、转膜，加入5%脱脂奶粉，室温封闭1 h；加入Col-Ⅰ抗体（1∶5 000稀释），4℃孵育过夜；TBST洗涤3次，每次10 min；加入α-SMA及FOXO1抗体（均1∶1 000稀释），室温孵育1 h；TBST洗涤3次，每次10 min；ECL发光液曝光，应用Image-J软件分析Col-Ⅰ、α-SMA及FOXO1蛋白表达量。

1.8 统计学分析 使用SPSS 22软件进行统计学分析，实验数据以均值±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠一般情况

2.1.1 生理状态 对照组全部存活，饮食及精神状态良好，反应迅捷，毛色黑亮，粪便呈棕黑色，体重稳定上升。模型组死亡1只，随着给药时间的增加，饮食尚可，精神状态变差，较对照组反应迟钝，毛色发灰、变糙，偶见脱毛，体重增长缓慢；ICG001及IT组较模型组精神状态好，毛色较黑亮，体重增长缓慢。

2.1.2 肝脏大体形态 对照组肝脏质软，表面光滑，色泽红润，边缘锐利；模型组肝脏质地变硬，肝组织色泽变暗变深，表面可见广泛米粒样突起，边缘凹凸不平；ICG001及IT组肝脏介于对照组与模型组之间，颜色较红润，质地较模型组软，仍可见米粒样突起。见图1。

图1 对照组（A）、模型组（B）、ICG001组（C）及IT组（D）小鼠肝脏大体形态Fig.1 Gross morphologies of mouse livers in control（A），model（B），ICG001（C）and IT（D）groups

2.1.3 肝脏指数 与对照组比较，模型组肝脏指数升高（t=3.14，P＜0.05）；与模型组比较，ICG001组肝脏指数显著下降（t=2.38，P＜0.05）；与ICG001组比较，IT组肝脏指数显著下降（t=3.27，P＜0.01）。见图2。

图2 各组小鼠肝脏指数Fig.2 Liver indexes of mice in various groups

2.2 小鼠血清中ALT及AST含量 与对照组比较，模型组ALT及AST含量均显著升高（t分别为18.36和8.83，P均＜0.01）；与模型组比较，ICG001组ALT及AST含量均下降（t分别为8.12和5.59，P均＜0.01）；与ICG001组比较，IT组ALT及AST含量均显著下降（t分别11.75及7.76，P均＜0.01）。见图3。

2.3 小鼠肝脏组织显微镜观察

2.3.1 HE染色 对照组肝小叶结构完整，肝细胞锁排列整齐，围绕中央静脉呈放射状。模型组炎细胞浸润增多，肝细胞变性、坏死，汇管区胶原纤维沉积；汇管区大量炎性细胞浸润，细胞间隙随处可见炎性细胞；细胞淡染，不易着色。ICG001组门静脉及中央静脉炎性细胞浸润，细胞间隙可见炎性细胞，较模型组减少；部分细胞可深染。IT组炎性细胞局限于门静脉及中央静脉，细胞间隙少见炎性细胞；部分细胞淡染。见图4。

2.3.2 网银染色 对照组肝脏血管及胆管管壁可见少量胶原纤维；模型组胶原纤维增生明显，粗大且有突起伸出，向肝实质内部延伸，呈不规则分布，部分在汇管区间或中央静脉与汇管区间相互连接，细胞淡染；ICG001组胶原纤维变细，突起减少，排列松散，较少向肝实质内部延伸，部分细胞可深染；IT组胶原纤维进一步减少，深染细胞较多。见图4。

注：aa表示P＜0.01。

2.4 肝脏组织中IL-6、IL-10、TNFα、FOXO1、α-SMA及Col-ⅠmRNA表达水平

2.4.1IL-6、IL-10及TNFα 结果显示，与对照组比较，模型组IL-6、IL-10及TNFαmRNA表达水平显著升高（t分别为10.61、6.48和89.83，P均＜0.01）；与模型组比较，ICG001组IL-6及TNFαmRNA表达水平下降（t分别为9.91和58.93，P均＜0.01），IL-10mRNA表达水平升高（t=3.67，P＜0.05）；与ICG001组比较，IT组IL-6、TNFαmRNA表达水平显著下降（t分别为5.39和4.54，P均＜0.05），IL-10mRNA表达水平显著升高（t=3.35，P＜0.05）。见图5。

2.4.2 α-SMA、Col-Ⅰ及FOXO1结果显示，与对照组比较，模型组α-SMA、Col-Ⅰ及FOXO1mRNA表达水平明显升高（t分别为22.92、13.73和10.06，P均＜0.01）；与模型组比较，ICG001组α-SMA及Col-ⅠmRNA表达水平降低（t分别为16.57和6.22，P均＜0.01），FOXO1mRNA表达水平差异无统计学意义（t=2.51，P＞0.05）；与ICG001组比较，IT组α-SMA及Col-ⅠmRNA表达水平降低（t分别为4.58和3.36，P均＜0.05），FOXO1mRNA表达水平升高（t=4.99，P＜0.01）。见图6。

2.5 肝脏组织中Col-Ⅰ、α-SMA及FOXO1蛋白表达水平 与对照组比较，模型组Col-Ⅰ、α-SMA蛋白表达水平均显著升高（t分别为7.22和17.72，P均＜0.01）；与模型组比较，ICG001组Col-Ⅰ及α-SMA蛋白表达水平均下降（t分别为8.08和8.42，P均＜0.01）；与ICG001组比较，IT组Col-Ⅰ及α-SMA表达水平均下降（t分别为5.87和4.22，P分别＜0.01和＜0.05）。对照组与模型组FOXO1蛋白表达水平差异无统计学意义（t=1.44，P＞0.05）；与模型组比较，ICG001组FOXO1蛋白表达水平差异无统计学意义（t=1.48，P＞0.05），与ICG001组比较，IT组FOXO1蛋白表达水平升高（t=3.51，P＜0.05）。见图7。

图4 HE及网银染色的各组小鼠肝脏组织显微镜观察（×200）Fig.4 Microscopy of liver tissues of mice in various groups with HE and reticular fiber staining（×200）

图5 各组小鼠肝脏组织中IL-6（A），IL-10（B）及TNFα（C）mRNA的表达水平Fig.5 Transcription levels of IL-6（A），IL-10（B）and TNFα（C）mRNAs in liver tissues of mice in various groups

图6 各组小鼠肝脏组织中α-SMA（A）、Col-Ⅰ（B）及FOXO1（C）mRNA的表达水平Fig.6 Transcription levels ofα-SMA（A）、Col-Ⅰ（B）and FOXO1（C）mRNAs in liver tissues of mice in various groups

图7 各组肝脏组织中Col-Ⅰ、α-SMA及FOXO1蛋白表达水平的Western blot分析Fig.7 Determination of expression levels of Col-Ⅰ，α-SMA and FOXO1 proteins in liver tissues of mice in various groups by Western blot

3 讨论

TGF-β为最有效抗炎细胞因子，也是最强致纤维化因子，TGF-β通路在肝纤维化过程中发挥着重要作用［9］。近年来，有研究针对TGF-β来治疗肝纤维化［10］，但在临床实验中表现不佳，从TGF-β下游通路中寻找新的靶点可能为研究提供新的方向。

叉头表达因子（forkhead box O，FOXOs）以果蝇果叉头基因命名，为一个编码FOXOs的亚家族；哺乳动物细胞中表达4种同工型FOXO（FOXO1、FOXO3、FOXO4及FOXO6）［11］，不同的亚型在多种疾病中发挥着多重作用及不同功能，其中FOXO1为研究最广泛的亚型，对多种疾病有多种影响［12-16］，其被上游分子调控并调节多种下游蛋白［17-18］。FOXO1可上调一系列细胞周期的抑制因子并促进凋亡，研究证实其可抑制成纤维细胞活化及随后的纤维化［19-21］。另外，FOXO1为TGF-β诱导的有效表达因子［22］，对TGF-β的抗炎功能至关重要。有学者提出，β-catenin是TGFβ通路的中心元件，结合FOXO1后β-catenin／FOXO1可使细胞周期停滞，促进细胞在应激下的存活［23］。FOXO1可抑制肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）的活化［24］，从而阻止肝纤维化的发生发展［25］。

本研究采用腹腔注射CCl4的方法成功建立了小鼠肝纤维化模型。小鼠腹腔注射CCl4后，模型组血清中ALT、AST水平明显高于对照组（P均＜0.01），肝组织HE染色呈现纤维组织沉积并形成假小叶的典型病理特征。经ICG001、ICG001联合TGF-β治疗，小鼠血清中ALT及AST水平明显降低（P均＜0.01）。组织病理学结果显示，经联合用药后肝细胞炎症、坏死及纤维组织的增生程度明显减轻。

ICG001联合TGF-β对CCl4诱导所致小鼠肝纤维化的治疗效果优于ICG001，IT组促炎指标IL-6、TNFαmRNA表达水平明显下降（P＜0.05），抗炎指标IL-10mRNA表达水平显著上升（P＜0.05）；纤维化指标α-SMA、Col-ⅠmRNA表达水平显著下降（P＜0.05），FOXO1mRNA表达水平明显升高（P＜0.01）。Western blot分析结果同样印证了PCR结论，与ICG001组相比，IT组Col-Ⅰ、α-SMA蛋白表达水平明显降低（P＜0.05），而FOXO1蛋白表达水平升高（P＜0.05）。

另外，ICG001对肝纤维化有一定的抑制作用，但并非作用于FOXO1发挥作用，可能与WNT通路相关［26］；ICG001联合TGF-β抑制肝纤维化表明，TGF-β通路为导致肝纤维化的主要影响因素［27］。

本研究提示ICG001联合TGF-β治疗对CCl4诱导致小鼠肝纤维化具有显著的干预作用，初步探讨了ICG001联合TGF-β抗肝纤维化作用的机理，这种抗纤维化作用可能与TGF-β通路下游元件与FOXO1的相互作用相关，具体的作用机制有待进一步研究。