右旋糖酐酶酶学特性及热失活动力学研究

常国炜，黎志德，黄曾慰，柳颖，刘桂云，梁达奉，张九花

(广东省科学院生物工程研究所 中国轻工业甘蔗制糖工程技术研究中心 广东省酶制剂与生物催化工程技术研究中心，广州 510316)

右旋糖酐酶(dextranase，EC3.2.1.11)是收录在GB 2760-2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》中的食品用酶制剂[1]，专一催化内切水解右旋糖酐的α-1，6-糖苷键[2]。近期有关右旋糖酐酶的研究热点是其与右旋糖酐蔗糖酶(dextransucrase，EC2.4.1.5)的联合应用，包括共固定化[3-4]和甜味剂在内的物质合成等[5-7]。在实际应用中，最主要的应用场景是制糖行业。制糖行业(包括甘蔗制糖、甜菜制糖、精炼糖)饱受葡聚糖问题(制糖行业所说的葡聚糖指的是右旋糖酐)影响[8-10]，而右旋糖酐酶正好能水解右旋糖酐，消除葡聚糖对制糖过程的不良影响[11-13]。酶制剂的使用与其他食品添加剂有所不同，因为酶制剂具有酶的特性，虽然高效、专一，但需要在较窄的合适条件进行酶促反应，在其他条件下会降低活性，甚至完全失活失效；酶制剂的添加量也要根据底物的浓度和实际工艺进行调整，盲目地提高添加量不一定能得到更好的效果。所以，使用酶制剂前需对其酶学特性有清晰了解，再结合实际生产工艺和环境，才能制定合理的使用方案，使酶制剂更好地发挥作用。本研究对广东省生物工程研究所(广州甘蔗糖业研究所)研发的右旋糖酐酶最适条件进行确定，研究常见食品添加剂对其酶活的影响，以及酶促反应动力学和热失活动力学参数，为制糖行业和其他行业应用该酶提供较详细的数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

右旋糖酐酶：基因来源于某毛壳菌属(Chaetomiumsp.)微生物(具体基因序列未公开发表)，由广东省生物工程研究所(广州甘蔗糖业研究所)提供；Dextran fromLeuconostocmesenteroides(平均摩尔质量1500000～2800000，下称T-2150)：经凝胶渗透色谱法[14]确定其数均分子量为230000 dal，美国Sigma-Aldrich公司；葡萄糖、十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、3,5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、苯酚、无水亚硫酸钠、无水硫酸钠、叠氮钠、蔗糖、磷酸、无水乙醇、苯甲酸钠、乙二胺四乙酸二钠、氯化钙：均为国产分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

HB43-S卤素水分测定仪、AL104电子天平 瑞士Mettler Toledo公司；pH 610台式酸度计 德国Wiggens公司；HWS-24型电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司；DTL21B电陶炉 合肥荣事达三洋电器股份有限公司；2800紫外可见光分光光度计 美国UNIC公司；DF-Ⅱ集热式磁力搅拌器 常州澳华仪器有限公司；LC-20A高效液相色谱仪(配置CTO-20AC柱温箱、SIL-20A自动进样器、RID-10A示差折光检测器、CBM-20A系统控制器) 日本Shimadzu公司；Shodex OHpak SB-806M HQ高效液相色谱填充柱 日本昭和电工株式会社。

1.3 试验方法

1.3.1 右旋糖酐酶活力测定

采用1.0 mL反应体系。底物溶液是用一定浓度和pH的Na2HPO4-KH2PO4缓冲液溶解T-2150至浓度为20 g/L。取0.95 mL底物溶液在反应温度下保温5 min，加入0.05 mL稀释一定倍数的右旋糖酐酶溶液，继续在该温度反应3 min后，加入2 mL DNS溶液(配制方法见参考文献[15])，沸水浴5 min后，用蒸馏水定容到10 mL，测定试验组的OD540。平行测定3次，取平均值表示最终酶活力。以加入灭活酶溶液的试验组做空白。酶活力单位(U)定义为：在最适反应条件(磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲溶液)下，反应3 min，每分钟催化右旋糖酐(平均分子量2150000 dal)生成1 μmol还原端(以葡萄糖计)所需要的酶量为一个活力单位。

1.3.2 右旋糖酐酶最适温度

固定pH为5.5、缓冲液浓度为0.05 mol/L，调节反应温度分别为50，55，60，65，70 ℃，按1.3.1的方法进行试验。

1.3.3 右旋糖酐酶最适pH

固定缓冲液浓度为0.05 mol/L，配制pH分别为5.0，5.5，6.0，6.5的底物溶液，固定反应温度为60 ℃，按1.3.1进行试验。

1.3.4 右旋糖酐酶最适离子强度

固定pH为5.5，配制缓冲液浓度分别为0.005，0.01，0.015，0.02，0.025，0.03，0.07，0.09 mol/L的底物溶液，固定反应温度为60 ℃，按1.3.1的方法进行试验。

1.3.5 右旋糖酐酶在碱性、乙醇条件下的稳定性

取适量酶液，稀释至一定倍数并用1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.5，8.5，9.5，在室温下静置30 min后，按1.3.1在最适条件下测定酶活力。

添加5%、10%、15%、30%(V/V)无水乙醇至蒸馏水中配制成乙醇溶液，用该乙醇溶液稀释酶液，在室温下静置30 min后，按1.3.1的方法在最适条件下测定酶活力。

1.3.6 食品添加剂对右旋糖酐酶的影响

取最适条件的底物溶液，分别内含苯甲酸钠、Na2SO3、Na2-EDTA、CaCl2且溶液中各物质浓度为2 mmol/L，按1.3.1的方法在最适条件下测定酶活力。

1.3.7 右旋糖酐酶动力学参数测定

分别取T2150浓度为4，8，12，16，20 g/L的最适底物溶液，按1.3.1的方法进行操作，5个浓度试验的酶液稀释倍数需要一致。计算出葡萄糖量后，换算成反应速度，运用Haldance方程(方程1)和变式(方程2)可做出Hanes-Woolf图，通过一元线性回归分析估计测定右旋糖酐酶的动力学参数Km和vmax。

(1)

(2)

式中：v为反应速率，μmol/min；vmax为最大反应速率，μmol/min；[S]为底物浓度，mol/L；Km为米氏常数，mol/L。

1.3.8 右旋糖酐酶的热失活动力学模型构建

将酶液和含200 g/L蔗糖的酶液于60 ℃水浴分别保温0～5 min，取出迅速放入冰浴中冷却。按1.3.1的方法以最适条件测定酶活力。以处理时间为横坐标，相对酶活力(方程 3)的对数值为纵坐标作图，得到热处理时间对右旋糖酐酶活性的影响曲线，以此曲线为基础，研究右旋糖酐酶在不同条件下的热失活动力学。

(3)

式中：At为热处理时间为t的样品酶活，U/mL；A0为热处理时间为0 min的样品酶活，U/mL；t为热处理时间，min。

1.3.9 热失活速率常数K、半衰期T1/2和D值的计算

描述酶耐热性的重要参数有：半衰期T1/2、D值。其中半衰期T1/2和10倍减少时间D值是用来描述酶稳定性的重要参数。半衰期越大，酶的热稳定效果越好。D值是指在一定的热力致死温度条件下，目标酶损失90%活力所需要的加热时间(s)，D值越大表示该酶的耐热性越强。

2 结果与分析

2.1 DNS法标准曲线的绘制

DNS溶液碱性和缓冲能力均强，针对本试验，不同反应体系在加入DNS后均能获得较一致的体系，不影响加热反应及后续测定。所以，不同反应体系能用同一条标准曲线。利用反应后的数据，做出标准曲线(见图1)，可以看出，零点和另外5点明显不在一条直线上，所以制作标准曲线时应剔除零点，只用5个点做标准曲线，其工作区间也相应从第一点开始，工作范围是0.024≤x≤0.484，R2=0.9975，表明标准曲线的拟合程度良好，能用于后续试验。

图1 DNS法葡萄糖质量-吸光度标准曲线Fig.1 The standard curve of glucose mass-absorbance by DNS method

2.2 温度对右旋糖酐酶活性的影响

由图2可知，反应温度为60，65 ℃时，酶活力优于其他温度，但两者较为接近。经显著性分析，表明60，65 ℃两组数据无显著性差异(P>0.05)，说明在60，65 ℃下酶活力的表现相当。在55～65 ℃范围内，酶分子能保持80%以上的反应活性；达到70 ℃时，酶活性下降至40%左右。

图2 反应温度对酶活力的影响Fig.2 The effect of reaction temperature on enzyme activity

2.3 pH对右旋糖酐酶活性的影响

由图3可知，pH为5.5时的酶活力最优，在pH 5～6内其活性仍能保持在80%以上。在另一个研究中，使用柠檬酸-Na2HPO4缓冲液、反应温度60 ℃和反应时间为10 min时，得到了类似的结果。虽然反应条件不同，但均能得出pH为5.5时反应较优，说明在该氢离子浓度下，酶蛋白的构象情况确实有利于酶促反应的进行，而且有机缓冲液和无机缓冲液在相同pH下对酶活的影响比较一致。

图3 pH对酶活力的影响Fig.3 The effect of pH value on enzyme activity

2.4 离子强度对右旋糖酐酶活性的影响

由图4可知，当缓冲液浓度为0.015 mol/L时，酶活力最优；当缓冲液浓度在0.02～0.1 mol/L时，酶活力基本相同，且只有最优时的77%左右。离子强度对该反应体系的影响复杂。右旋糖酐和酶分子都是高分子，离子强度对高分子链的构象有影响。对于右旋糖酐糖链，离子强度可能影响其均方旋转半径和分子链刚性度等性质，即会影响糖链的延展程度，这会影响糖链和酶分子作用位点的结合，从而影响其反应情况。对于酶分子，离子强度可能对其二级结构和分子表面疏水性等构象问题有影响，从而影响其反应情况。由于影响因素复杂，通过简单的试验难以解释产生差异的具体原因。

图4 离子强度对酶活力的影响Fig.4 The effect of ion strength on enzyme activity

2.5 右旋糖酐酶在碱性、乙醇条件下的稳定性

由表1可知，右旋糖酐酶在高pH(最高至9.5)和高乙醇浓度环境(最高至添加30%乙醇，更高浓度乙醇环境会导致底物中T-2150析出)常温存放30 min后，其活力和原酶液没有显著性差异(P>0.05)，说明右旋糖酐酶在该不利条件下对其影响是完全可逆的。

表1 常温下右旋糖酐酶稳定性研究Table 1 The stability of dextranase at normal temperature

2.6 食品添加剂对右旋糖酐酶的影响

选取部分常见的食品添加剂，测定其对右旋糖酐酶活力的影响，结果见表2。只有Na2SO3对右旋糖酐酶有显著的抑制作用(P<0.05)，其他均无显著性差异。制糖工艺中存在硫熏处理，该处理亚硫酸根浓度可能较高，可能会影响右旋糖酐酶的活性。

表2 食品添加剂对右旋糖酐酶的影响Table 2 The effect of food additives on dextranase activity

2.7 右旋糖酐酶酶促反应动力学

由于右旋糖酐酶催化右旋糖酐中的α-1,6-糖苷键水解，生成两条糖链，仍是右旋糖酐糖链，即底物和产物是同一类物质，难以区分。探究其反应原理，本质上是催化右旋糖酐的α-1,6-糖苷键，所以可用可反应的α-1,6-糖苷键量来表示底物浓度。所以，作图时需要知道的[S](方程4)和V(方程5)的计算公式是：

(4)

式中：[S]为反应体系中可反应α-1,6-糖苷键的浓度，mol/L；w为底物溶液右旋糖酐浓度，g/L；0.00095为反应体系中底物溶液加入量，L；230000为右旋糖酐数均分子量，g/mol；1346为平均一条右旋糖酐糖链上可反应的α-1,6糖苷键的个数；0.001为反应体系的体积，L。

v=m×1000÷180÷3。

(5)

式中：v为反应速率，μmol/min；m为利用标准曲线计算得到的还原端增量(以葡萄糖计)，mg；1000为单位转换系数，μg/mg；180为葡萄糖的摩尔质量，μg/μmol；3为反应时间，min。

经计算后，以[S]为横轴、[S]/v为纵轴，能得到5个点，并拟合出一直线，其图形见图5，其回归方程为y=3.781x+0.04994，相关系数R2=0.9875，进一步验证了右旋糖酐酶的酶促反应动力学符合米氏方程，根据直线斜率和截距求得该反应的米氏常数Km=0.01321 mol/L，vmax=0.2645 μmol/min，根据稀释倍数可以得出vmax=0.5153 μmol/(min·U)。

图5 Hanes-Woolf图Fig.5 Hanes-Woolf diagram

2.8 右旋糖酐酶的热失活动力学

为进一步研究右旋糖酐酶保存和应用时的热稳定性，将含200 g/L蔗糖的酶液和原酶液在60 ℃保温不同时间后冰浴冷却。以相对酶活力的自然对数 ln(At/A0)与处理时间t进行线性回归。由图6可知，两酶液均受时间影响显著，随着热处理时间的延长，酶蛋白快速变性失活，同时，时间与相对酶活力的自然对数曲线在各温度下均呈线性关系(相关系数R2均大于0.98)，表明右旋糖酐酶的热失活遵循一级反应动力学规律，即失活速率常数K与热处理时间t满足以下方程(方程6)：

图6 热处理对酶活的影响Fig.6 The effect of heat treatment on enzyme activity

相对酶活(%)=e-Kt×100。

(6)

式中：K为热失活速率常数，min-1。

方程3与方程6相等，并对其运算得到下列方程(方程7)：

(7)

得到K值后，可根据(方程8)和(方程9)计算出半衰期T1/2和D值。

T1/2=ln(2)/K。

(8)

D=ln(10)/K。

(9)

根据直线的斜率以及方程8，9得到各参数，见表3。含200 g/L蔗糖的T1/2比不含蔗糖的高14.8%，说明蔗糖对酶有一定保护作用。该条件恰好是制糖物料中的常见蔗糖浓度，说明该酶在制糖过程中使用热稳定性有所提升，能更好地发挥作用。

表3 右旋糖酐酶失活的一级动力学模型参数Table 3 The parameters of first-order kinetics model for inactivation of dextranase

3 结论

该右旋糖酐酶的最适温度、pH和离子强度分别为60/65 ℃，5.5，0.015 mol/L；pH 5.5～9.5或乙醇添加量0%～30%的环境常温保存30 min，酶活性保持相对稳定；酶促反应动力学符合米氏方程所描述的单底物酶促反应动力学，其Km和vmax分别为0.01321 mol/L、0.5153 μmol/(min·U)；右旋糖酐酶的热失活遵循一级反应动力学规律，在60 ℃、含蔗糖0，200 g/L的环境下热失活速率常数为0.1268，0.1105 min-1，半衰期分别为5.466，6.273 min。2 mmol/L亚硫酸钠对右旋糖酐酶活性具有抑制作用(P<0.05)。该试验为制糖行业和其他行业应用该酶提供了较详细的数据支持。