利用生物信息学分析方法研究糖酵解相关基因在宫颈癌组织中的表达谱

韩小玲，凌志甫，韩俏英

（广东医科大学，广东 东莞 523808）

宫颈癌是女性生殖系统常见的三大恶性肿瘤之一。近几年，该病的发病率和死亡率均呈逐渐上升的趋势。据统计，全球每年约有53 万新发宫颈癌患者，每年约有27.5 万宫颈癌患者死亡[1]。近三十年来，我国宫颈癌的发病率提高了10% ～40%，每年新发宫颈癌患者的数量超过14 万，每年死亡的宫颈癌患者数量约为3.7 万。宫颈癌已成为我国年轻女性发病率较高的妇科恶性肿瘤之一[2]。积极地探索宫颈癌发生、发展的机制、新的诊断和治疗靶点具有重要的临床意义。肿瘤组织的代谢情况与正常组织不同，具有代谢重编程的显著特点。肿瘤组织即使在有氧的条件下，仍以糖酵解为主要代谢方式，即存在Warburg 效应[3]。糖酵解是肿瘤组织特有的代谢方式。肿瘤组织糖酵解的程度与其进展情况具有密切的联系。有多个糖酵解相关基因会参与调控糖酵解，并影响宫颈癌的发生和发展。但目前对于这些基因在宫颈癌发生和发展中的具体作用仍未可知。生物信息学分析方法是基于高通量芯片和测序技术发展起来的一种研究方法。生物信息学分析方法的出现为人们探索疾病的发展过程提供了新的方法。本文主要是利用生物信息学分析方法研究多个糖酵解相关基因在宫颈癌组织中的表达谱。

1 资料与方法

1.1 数据来源

从肿瘤基因组图谱计划（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库（https://portal.gdc.cancer.gov/）下载2020年11 月20 日前收集的宫颈癌转录组数据。数据类型为FPKM 形式。该数据集来自3 例正常宫颈样本和306 例宫颈癌样本。然后将下载后的转录组数据进行基因重注释。从基因富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）数据库（https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp）下载与糖酵解相关的基因集。该数据集包括383 个糖酵解相关基因。提取TCGA 数据库宫颈癌数据集中存在上述糖酵解相关基因的表达谱。

1.2 生物信息学分析方法

利用R 软件中的limma 包对383 个糖酵解相关基因进行差异分析。删除在样本中表达较低的基因，按照过滤条件（差异倍数绝对值大于1.5，且P 值＜0.01）筛选基因。借助R 软件的clusterprofiler 包对识别出的差异基因进行GO 功能和KEGG 通路富集分析。基于在线网站String（https://string-db.org/）构建的糖酵解相关差异基因蛋白互作网，利用cytoscape 软件中的cytohubba 插件对这些差异基因进行蛋白互作网络分析。按照degree 大于10 的标准，识别蛋白互作网络中的核心基因。

2 结果

2.1 筛选差异基因的结果

本次研究中共筛选出76 个差异基因。其中包括54 个基于正常宫颈组织基因上调的差异基因，22 个基于正常宫颈组织基因下调的差异基因。

2.2 对这些差异基因进行GO 功能和KEGG 通路富集分析的结果

对这些差异基因进行GO 功能富集分析的结果显示，这76 个差异基因显著富集在能量代谢、能量合成等生物学过程中。详见表1。对这些差异基因进行KEGG 通路富集分析的结果显示，这76 个差异基因显著富集在与氨基酸、糖代谢相关的通路上。详见表2。

表1 对这些差异基因进行GO 功能富集分析的结果

表2 对这些差异基因进行KEGG 通路富集分析的结果

2.3 对这些差异基因进行蛋白互作网络分析的结果

在这些差异基因中， 有CDK1、NDC1、NUP107、PFKM、IGF1 和HK2 六个可识别的蛋白互作网络核心基因。

3 讨论

近年来，高通量芯片和测序技术得到飞速的发展，TCGA 及GEO 等公共肿瘤数据库存储的肿瘤组织转录组数据不断完善，科研人员已经可以借助这些技术和平台对肿瘤基因进行生物信息学分析。这为临床上进行肿瘤学研究开辟了一个新的思路。使用生物信息学分析方法进行科研所需的经费少，耗时较短，无需科研人员自己在临床上寻找病例。TCGA 是由美国国家癌症研究所（National Cancer Institute，NCI）和国家人类基因组研究所（National Human Genome Research Institute，NHGRI）合作绘制出的涵盖多种肿瘤类型及亚型、多维度关键基因组变化的图谱。TCGA是目前最大的储存癌症基因信息的数据库。TCGA 中收集了大量各种癌症的基因表达数据、miRNA 表达数据、拷贝数变异数据、DNA 甲基化数据、SNP 数据及临床研究数据[4-5]。科研人员可以通过对TCGA 数据库中的相关数据进行分析和整合，探索肿瘤的发生、发展、诊断、风险分层、治疗策略及患者的预后等。宫颈癌是临床上常见的妇科恶性肿瘤之一。目前临床上主要使用手术、放疗、化疗等多种治疗方法治疗宫颈癌。在发病早期和中期接受科学有效治疗的宫颈癌患者通常可以获得较好的预后。但在病情进展到晚期才接受治疗的宫颈癌患者在发病后5 年的生存率仍较低[6]。探索对宫颈癌患者进行治疗的新靶点具有重要的意义。与正常组织进行有氧氧化代谢不同，肿瘤组织代谢的方式倾向于进行无氧糖酵解。与肿瘤组织糖酵解相关的课题是目前肿瘤学研究领域中比较热门的课题。目前关于糖酵解与宫颈癌发生、发展及结局关系的研究比较缺乏，现有的部分研究往往将研究目标集中在单个分子上。生物信息学分析方法是基于高通量芯片和测序技术发展起来的一种研究方法。该方法为科研人员研究多个分子与疾病的相关性提供了便利。本次研究中，我们提取TCGA 数据库中宫颈癌转录组多个糖酵解相关基因的数据，利用生物信息学方法系统地分析了多个糖酵解相关基因在宫颈癌组织中的表达情况、功能及通路等，为深入开展宫颈癌领域的研究奠定了基础，也为临床进一步选取治疗靶点打开了新的思路。

本次研究中，我们利用R 软件中的limma 包对数据样本进行差异分析，筛选出了76 个差异基因。其中包括54个基于正常宫颈组织基因上调的差异基因，22 个基于正常宫颈组织基因下调的差异基因。这从基因角度印证了多个糖酵解相关基因可参与宫颈癌的发生和发展。对这些差异基因进行KEGG 通路富集分析的结果显示，这76 个差异基因显著富集在与氨基酸、糖代谢相关的通路上。富集在这些通路中的HK2 又被称为己糖激酶，可催化己糖磷酸化。HK2 是糖酵解途径中的第一个酶，也是糖酵解途径的限速酶。正常情况下，HK2 在哺乳动物中呈高度保守的特性。相关的研究结果显示，HK2 基因可拮抗经线粒体途径的细胞凋亡[7]。在肿瘤细胞中，约60% 的ATP 来源于糖酵解过程。已有研究证实，在被切除的肺、胃肠及乳腺恶性肿瘤组织中，HK2 的含量明显增高[8-9]。富集在这些通路中的PCK2 即线粒体磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶2，是糖异生途径中的关键限速酶。PCK2 是健康组织代谢过程中连接三羧酸循环、糖酵解和糖异生的枢纽分子，可为组织代谢提供足够的能量和中间体[10]。PCK2 在多种肿瘤组织中均呈异常表达。PCK2 既具有促进肿瘤进展的作用，又具有抑制肿瘤进展的作用。本次研究中我们发现，与正常的宫颈组织相比，宫颈癌组织中的PCK2 呈高表达趋势。这提示，PCK2 在宫颈癌组织中或许属于一种抑癌分子。本次研究中，我们利用cytoscape 软件中的cytohubba 插件对这些差异基因进行蛋白互作网络分析，结果识别出CDK1、NDC1、NUP107、PFKM、IGF1 和HK2 六个核心基因。在目前对宫颈癌的相关研究中，针对上述6 个基因开展的研究均较少。这些基因可作为今后研究宫颈癌发生机制的重要靶点。

综上所述，宫颈癌组织中存在多个与正常宫颈组织基因存在差异的糖酵解相关基因。这些差异基因显著富集在与能量代谢相关的功能和通路上。在这些差异基因中，有CDK1、NDC1、NUP107、PFKM、IGF1 和HK2 六个可识别的蛋白互作网络核心基因。