105例呼吸机相关性肺炎患者肺炎克雷伯菌临床与微生物学特征分析*

许晶晶， 韦 娜△， 付敬杰， 肖 琳， 寇俊娜， 张慧峰， 郭 思

1郑州大学第一附属医院病理科，2河南省肿瘤病理重点实验室，郑州 450052 河南省人民医院 3重症医学科 4检验科，郑州 4500035阜外华中心血管病医院检验科，郑州 450003

呼吸机相关肺炎(ventilator associated pneumonia，VAP)是常见的医院内感染，其发生率为8%～28%[1]。而且，研究证实VAP的病死率为24%～76%，高于其他类型的医院内感染。肺炎克雷伯菌是社区和医院感染中常见的致病菌，可以引起肺炎、腹部感染、尿路感染、导管相关感染等。肺炎克雷伯菌根据其黏液表型分为经典肺炎克雷伯菌(classicKlebsiellapneumoniae，cKP)和高黏液性肺炎克雷伯菌[hypervirulent(hypermucoviscous)Klebsiellapneumoniae，hvKP]，其中cKP是造成医院感染的主要病原菌[2]。hvKP是近年来发现的一种强致病力肺炎克雷伯菌的新型变种，其致病力、侵袭性显著强于cKP，故也被命名为高毒力肺炎克雷伯菌[3-4]。与cKP不同的是，hvKP主要造成社区性感染，能够在健康人群中引起威胁生命的感染，这种情况已引起世界范围内的重视[3]。近年来，我国关于hvKP感染的报道逐年增加[5-6]。但是大多数研究都集中在hvKP引起的社区获得性感染。然而，关于hvKP引起VAP感染的临床及微生物学特征的研究报道少见。本研究以呼吸机相关性肺炎患者中分离的肺炎克雷伯菌为研究对象，对其高黏液性、耐药性、荚膜血清型、相关毒力基因和多位点分型(MLST)进行了分析，以便为临床用药及控制其传播提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源及临床数据收集

收集2013年1月至2018年12月在河南省人民医院ICU临床诊断为VAP，并且肺泡灌洗液中分离鉴定的肺炎克雷伯菌≥104CFU/mL患者的临床资料，并将分离所得肺炎克雷伯菌作为本研究的实验菌株。VAP诊断标准为：机械通气>48 h或拔管<48 h内发生肺炎，与机械通气之前比较，患者肺部出现新的浸润性阴影或炎症病灶，肺实变征和(或)湿性罗音。并具备以下条件之一者：①外周血白细胞>10×109/L或<4×109/L；②体温>37.5℃，呼吸道分泌物增多且有脓性；③肺泡灌洗液连续2次培养出同一致病菌。多重细菌感染所造成的VAP患者不纳入本研究。临床数据的收集包括年龄、性别、机械性通气时间、基础疾病等。

1.2 主要仪器和试剂

Vitek 2 compact全自动微生物鉴定仪(法国梅里埃生物公司)，PCR仪(德国Eppendorf公司)，电泳仪(美国Bio-Rad公司)，凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)，PCR试剂盒、DNA Marker、ExTaq酶购自大连TaKaRa公司。PCR扩增引物与双向测序由Invitrogen公司完成。

1.3 菌株鉴定及抗菌药物敏感性试验

细菌鉴定采用VITEK-2 Compact全自动细菌鉴定仪。抗菌药物的敏感性采用VITEK-2 Compact全自动细菌鉴定仪与纸片扩散法(K-B法)。药敏结果判断参照美国临床实验室标准化研究所CLSI 2014 M100-S24的推荐标准[7]。采用双纸片协同试验进行超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)检测。大肠埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603作为质控菌株。

1.4 高黏液性(hypermucoviscosity，HM)表型试验

将肺炎克雷伯菌接种于含5%羊血的琼脂平板上，置于CO2培养箱35℃培养16～18 h后，用细菌接种环轻轻向上挑起菌落，如挑起黏液丝≥5 mm[3]，则为HM表型阳性。

1.5 荚膜血清分型及相关毒力基因检测

PCR检测荚膜血清型(K1、K2)及相关毒力基因rmpA和aerobactin，引物与扩增条件参见文献[8-9]。

1.6 多位点序列分型(MLST)

应用MLST对检出的肺炎克雷伯菌进行基因分型。扩增肺炎克雷伯菌基因组上的7个管家基因：gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB、tonB，然后对PCR产物进行测序。在http：//pubmlst.org/kpneumoniae网址上，比对确定菌株的等位基因谱和序列型(STs)。

1.7 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，组间比较采用秩和检验，率的组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。使用WHONET 5.6软件统计分析细菌对抗菌药物的敏感性。

2 结果

2.1 肺炎克雷伯菌的高黏液表型

肺炎克雷伯菌的菌落通常湿润、光滑，部分菌落具有高黏液性状。105株肺炎克雷伯菌中，24.8%(26/105)为hvKP，拉丝试验为阳性。

2.2 肺炎克雷伯菌相关VAP患者临床特征

本研究回顾性分析了105例肺炎克雷伯菌相关VAP患者。患者的平均年龄为(58±14)岁，其中男性77例，女性28例。上述患者分离出hvKP 26株，cKP 79株，其对应VAP的临床分析见表1。结果显示hvKP患者与cKP患者相比，菌血症发生率显著升高(34.6%vs.3.8%)，病死率也明显升高(53.8%vs.12.7%)。

表1 肺炎克雷伯菌呼吸机相关肺炎患者的临床特征[例(%)]Table 1 Clinical characteristics of K.pneumoniae from mechanically ventilated patients[n(%)]

2.3 肺炎克雷伯菌的生物学特征分析

在分离出的肺炎克雷伯菌中，hvKP为26株(24.8%)，cKP为79株(75.2%)。结果进一步显示高黏液性表型与rmpA、aerobactin毒力基因呈高度相关性。26株hvKP中，88.5%(23/26)的菌株具有rmpA与aerobactin基因，并且rmpA与aerobactin基因同时存在于hvKP中。所有cKP菌株rmpA与aerobactin基因都呈阴性。hvKP中，血清型K1、K2所占的比例分别为15.4%(4/26)与26.9%(7/26)。cKP中没有发现K1、K2血清型(表2)。

表2 肺炎克雷伯菌呼吸机相关肺炎病原分子特征[例(%)]Table 2 Microbiological characteristics of K.pneumoniae from mechanically ventilated patients[n(%)]

2.4 抗生素敏感性试验

结果显示hvKP对常用抗生素的敏感性均明显高于cKP(表3)。产ESBLs菌株检出率49.5%(52/105)，其中产ESBLs的cKP比例(62.0%，49/79)显著高于产ESBLs hvKP的比例(11.5%，3/26)。

表3 高黏液性肺炎克雷伯菌和经典肺炎克雷伯菌对常用抗菌药的敏感性[例(%)]Table 3 Difference of the antimicrobial susceptibility between hypermucoviscous and classic K.pneumoniae[n(%)]

在所有检测菌株中只检测出3株cKP对亚胺培南与美罗培南耐药。

2.5 肺炎克雷伯菌MLST分型

MLST显示105株临床分离株共有24个ST型，hvKP与cKP没有共同的ST型别，详见使用PasteurMLST网站产生的最小生成树分析(图1)。26株hvKP共有11个ST型，表明其是多克隆传播，但是从VAP患者呼吸道分离的5例hvKP属于同一个ST型(ST23)，提示是克隆相关传播。并且ST23在hvKP菌株中所占比例最高(19.2%，5/26)。79株cKP菌株鉴定出13种ST分型，同样显示其多克隆传播。在cKP株中，主要流行株是ST11(24.1%，19/79)和ST15(22.8%，18/79)(表2)。

图1 MLST基因型数据最小生成树分析26株高黏液性肺炎克雷伯菌(A)与79株经典肺炎克雷伯菌(B)(PasteurMLST网站分析)Fig.1 Minimum-spanning tree of 26 isolates of hypermucoviscous K.pneumonia (A)and classic K.pneumonia (B)(analysis at PasteurMLST website)

3 讨论

HvKP是近年来发现的一种强致病力肺炎克雷伯菌的新型变种，主要引起社区获得性感染，而在医院感染中检出率不高[5]。有报道称hvKP主要在亚太地区流行，近年来播散至全球。hvKP造成的感染，包括肝脓肿、眼内炎和严重的肺炎等，但关于hvKP相关VAP的研究和报道较少。本研究分析了105株肺炎克雷伯菌引起VAP患者的临床特征及菌株的微生物学特征。我们发现VAP患者下呼吸道分离出hvKP 26株(24.8%，26/105)，cKP 79株(75.2%，79/105)。hvKP检出比率高于之前报道的结果。本研究表明肺炎克雷伯菌相关VAP以cKP为主，但hvKP在VAP中的传播比例在提高。

我们进一步分析肺炎克雷伯菌VAP的临床特征，结果显示hvKP引起的呼吸机相关肺炎菌血症的发生率显著高于cKP引起的菌血症(34.6%vs.3.8%，P<0.01)，并且hvKP病例组的病死率也高于经典肺炎克雷伯病例组(53.8%vs.12.7%，P<0.01)。上述结果表明，在VAP中hvKP引起的感染严重，其致病性要高于cKP。

我们进一步分析了hvKP与cKP之间毒力因子的差异。肺炎克雷伯菌毒力基因中，rmpA是细菌胞外荚膜多糖合成过程中重要的调节基因[10]，能够促进高黏液菌落表型的形成。hvKP胞外较厚的多糖荚膜，可以对抗白细胞吞噬作用，介导菌体抵抗宿主免疫杀伤，同时具有抗血清杀菌(补体系统)的能力。aerobactin则可使细菌竞争获取宿主组织中的铁以增强其存活能力。有研究报道，动物模型中aerobactin可使肺炎克雷伯菌的毒力增加100倍[11]。研究发现rmpA基因位于一个180 kb大小的毒力相关质粒上，该质粒还含有其他毒力相关基因，包括aerobactin[12]。本研究也发现hvKP中rmpA与aerobactin基因是协同存在于hvKP中，而cKP不含上述2种毒力基因，这使得hvKP的毒力要强于cKP。这种高毒力性也印证了上述临床结果中hvKP引起的严重感染。K1和K2被认为是hvKP的重要毒力血清型[13-14]。之前研究表明K1和K2型在医院获得性肺炎中的检出比例(2/18，11%)低于社区获得性肺炎中的检出比例(23/49，47%)[12]。本研究结果同上述结论相似，我们也发现在VAP中分离的肺炎克雷伯菌中，K1和K2型的检出率不高为10.5%(11/105)。本实验结果中所有K1、K2型均为hvKP，cKP中无K1、K2型。同之前的报道hvKP很少引起院内感染不同的是，本研究hvKP在院内感染VAP中检出比例为24.8%(26/105)。上述临床结果提示非K1、K2血清型hvKP由社区获得性感染正逐步向医院获得感染转变。

有研究表明高黏液性菌株对抗生素耐药比较少见[15]。然而，最近已有研究报道了多重耐药高黏液性菌株引起的感染病例[16]。在本实验中hvKP对大多数抗生素的敏感性要高于cKP，但有3株高黏液性菌株产ESBLs。上述结果表明随着高黏液性菌株在院内感染中的持续存在，其可通过获取耐药基因成为高毒力合并高耐药菌株。

在105例菌株中，一共鉴定出24种ST型。高黏液性菌株鉴定出11种ST型，该结果提示了在VAP中，高黏液性菌株是多克隆来源的。但有5例VAP患者分离出的高黏液性菌株为同一ST型别(ST23)，表明其是克隆相关感染。79例经典菌株鉴定出13种ST型别，其中ST11型和ST15型最普遍，分别为ST11型19株，ST15型18株。高黏液性菌株和经典菌株没有共同的ST型别，表明这两种类型的肺炎克雷伯菌具有不同的遗传背景。

综上所述，本研究分析了VAP患者下呼吸道肺炎克雷伯菌分离株的临床及微生物学特征，与传统观点普遍认为hvKP通常引起社区性感染不同的是，hvKP已经成为院内感染VAP的常见致病菌。而VAP患者感染hvKP后有较高的病死率且更容易并发菌血症。随着hvKP在医院院内感染的持续存在，其对抗生素的耐药性也将提高。我们希望提醒医学检验科特别注意检测肺炎克雷伯菌的黏液性状、荚膜血清型和抗菌药物敏感性，并及时与临床沟通，从而帮助临床医师更迅速有效地控制高黏液性菌株引起的VAP。