P210抗体减轻内皮损伤抑制动脉粥样硬化*

李松海， 曾状林， 冮洪生 △， 魏宇淼 △

1武汉市第四医院，华中科技大学同济医学院附属普爱医院心血管内科，武汉 4300332华中科技大学同济医学院附属协和医院心血管内科，武汉 430022

动脉粥样硬化性心脑血管病死亡占我国城乡人口死亡的40%以上，虽然现有的诊治措施取得了较好的临床效果，但这一疾病所造成的人群死亡数目仍在上升[1]。动脉粥样硬化的发生机制复杂，主流观点是血管壁在高脂状态下过度的脂质沉积以及血管壁对脂质成分的慢性进展性炎症反应，动脉粥样硬化的形成与脂质代谢异常关系密切[2]。

血管壁胆固醇沉积及血管壁相关细胞功能损害是动脉粥样硬化血管损害的核心发病机制[3-4]，低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)受体广泛存在于肝、动脉壁细胞等全身各组织的细胞膜表面，当血浆中LDL与其受体结合后，受体聚集成簇，内吞入细胞与溶酶体融合。但随着细胞内胆固醇水平的上升，细胞通过下调LDL受体功能，以避免胆固醇的过量沉积。组成LDL的载脂蛋白B(ApoB)分子巨大(包含4536个氨基酸残基)，1分子ApoB可与大约700个磷脂分子、600个游离胆固醇分子、1600个胆固醇酯分子、185个三酰甘油形成一个复杂的蛋白-脂质组合体，在机体复杂的内环境状态下极易氧化，在一氧化氮合成酶(NOS)及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH oxidase，Nox)及髓过氧化物酶(MPO)的作用下，形成氧化型LDL(Ox-LDL)，产生大量抗原决定簇的改变[5]。因LDL的氧化及其抗原决定簇的改变而产生氧化反应特异性表位(oxidation-specific epitope，OSE)，使得机体炎症相关吞噬细胞、血管内皮细胞及平滑肌细胞可以通过其固有的模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)对Ox-LDL进行吞噬，这类受体在巨噬细胞突出表现为类型众多的清道夫受体(scavenger receptor，SR)和Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)[6]。清道夫受体现已发现10余种，包括A类清道夫受体SRA1及SRA2(SRA，识别富含半胱氨酸结构域)、B类清道夫受体如SR-BI及CD36，以及主要表达于血管内皮细胞的E类清道夫受体(清道夫受体血凝素结构域)即血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1，LOX-1)。内皮细胞主要通过LOX-1进行Ox-LDL的结合、吞噬、降解并引起内皮细胞功能障碍和相关损害。因此如何减轻Ox-LDL通过LOX-1诱导的内皮屏障受损，维持良好的内皮细胞生存状态对防治动脉粥样硬化具有重要意义。

大量研究表明以Ox-LDL及其载脂蛋白片段进行主动免疫可以有效减少动脉粥样硬化病变，其中特异性片段P210在ApoE基因敲除小鼠模型中的保护效果尤为突出，但具体机制尚未阐明[7]。基于此我们通过构建体外模型探究特异性P210抗体保护内皮细胞减轻动脉粥样硬化的机制。

1 材料和方法

1.1 主要材料与试剂

原代人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)由教育部分子靶向治疗重点实验室(心血管免疫实验室)提供。ECM培养液及血清购自美国Gibco公司，胰蛋白酶购自Amresco公司，Hoechest 33258购自碧云天公司，Bax、Bcl-2、ZO-1抗体购自Cell Signaling Technology公司，内参GAPDH、β-actin抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司，其余试剂均为国产分析纯。牛血清白蛋白、油红染液、DAPI染液、Calcein Am染液购自武汉谷歌生物科技有限公司，Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡试剂盒(BD，美国)购自上海优宁维公司，BCA蛋白检测试剂盒均购于Pierce公司，Cocktail混合蛋白酶抑制剂、全蛋白裂解液购自武汉安特捷公司，Western配胶试剂盒购自碧云天生物技术公司，Ox-ApoB特异性多肽片段P210合成及其特异性抗体的制备、提纯由武汉安特捷生物有限公司辅助完成，5%脱脂牛奶、甲醇、异丙醇、氯仿、无水乙醇、10 ×丽春红溶液等辅助试剂均购自武汉谷歌、大风或安特捷生物有限公司。

1.2 细胞培养及实验分组

细胞培养于专用的内皮细胞培养液ECM中，均置于21%O2、5%CO2、37℃、饱和湿度的培养箱中。用含1%～2% FBS的培养液培养24 h(饥饿处理)后，将细胞分为3组，对照组：未加Ox-LDL和Ab(P210抗体)；Ox-LDL组：分别加入25、50及100 μg/mL Ox-LDL(3个亚组)；Ox-LDL+Ab组：在50 μg/mL Ox-LDL存在下，分别加入100和200 ng/mL Ab(2个亚组)。

1.3 流式细胞术检测

Annexin Ⅴ-FITC/PI双染试剂盒检测HUVEC细胞的凋亡：①10× Binding Buffer用ddH2O稀释成1× Binding Buffer；②用不含EDTA的0.25%的胰酶消化HUVEC(EDTA会与Ca离子螯合，影响Annexin Ⅴ的结合)，显微镜下密切监测消化程度，避免过度消化。室温下离心(1000 r/min，5 min)，收集细胞；③用4℃预冷的1×PBS缓冲液重悬细胞，离心(1000 r/min，5 min)，重复上述操作1次；④用1× Binding Buffer重悬细胞，调整细胞密度至1×106/mL，取200 μL细胞悬液至流式管中；⑤每管加入5 μL Annexin Ⅴ，混匀，室温避光孵育15 min；⑥流式上机前5 min加入5 μL PI避光染色，上机前酌情补加适量1× Binding Buffer。

1.4 Western blot检测细胞Bax、Bcl-2、ZO-1蛋白的表达

将培养液从细胞培养板中吸出，每孔加入100 μL混有蛋白酶抑制剂的RIPA细胞裂解液，转入4℃预冷EP管中振荡裂解，离心，测浓度，分装。跑胶，湿转到PVDF膜。将PVDF膜浸没于TBST配制的5%脱脂牛奶溶液中，室温下摇床封闭2 h左右。加入一抗稀释液(稀释度1∶1000，根据抗体说明书调整)，冰上摇匀1～2 h，4℃冰箱过夜。TBST洗涤10 min × 3次。加入HRP标记的稀释二抗，室温孵育2 h。弃掉二抗溶液，TBST洗涤10 min × 3次。准备ECL溶液，溶液A与溶液B等体积混匀，现配即用。将ECL溶液均匀加于膜上，室温1 min。去除ECL溶液，Bio-Rad化学发光仪检测，Image Lab软件计算蛋白条带灰度值。

1.5 细胞免疫荧光检测ZO-1的表达

不同处理组的细胞爬片用PBS清洗，4%多聚甲醛固定10 min，PBS清洗后10%山羊血清封闭30 min。加入适量PBS稀释的相应一抗，放入湿盒内4℃过夜。常温复温1 h，PBS清洗5 min × 3次。加入PBS稀释的荧光标记二抗，常温孵育1 h。PBS清洗5 min × 3次。DAPI复染核5 min，滴加防荧光淬灭封片剂封片。避光4℃放置，24 h内拍照储存。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 P210抗体可以减少Ox-LDL所致内皮细胞凋亡坏死

流式细胞术检测显示(图1A)：与对照组(a)比较，Ox-LDL可引起原代HUVEC凋亡坏死，并随Ox-LDL浓度增加(25，50，100μg/mL)呈梯度变化，P210抗体可以减少该变化。Western blot检测显示(图1B)：促凋亡蛋白Bax与抗凋亡蛋白Bcl-2比值随着Ox-LDL浓度增加而表达增加，且这一作用可被P210抗体所改善。说明Ox-LDL可诱导内皮细胞凋亡坏死，P210抗体可抑制这一作用。

2.2 P210抗体可以减少内皮细胞内脂质沉积

激光共聚焦示：红色荧光探针Dil标记的Ox-LDL可被内皮细胞(钙黄绿素Calcein Am活体染色)吞噬，沉积于细胞质内，P210抗体可以减少内皮细胞内脂质沉积(图2)。

与Ox-LDL组比较，**P<0.01

2.3 P210抗体能减轻Ox-LDL对内皮细胞紧密连接蛋白表达的抑制作用

激光共聚焦及Western blot检测示：Ox-LDL可以抑制人脐静脉内皮细胞紧密连接蛋白ZO-1的表达，P210抗体处理能显著减轻该抑制效应。说明抗体对Ox-LDL所引起的内皮细胞紧密连接破坏亦有保护效应(图3)。

与对照组比较，**P<0.01；与Ox-LDL(50 μg/mL)组比较，##P<0.01

3 讨论

动脉粥样硬化性疾病给人类的健康带来极大的危害，对其发病机制进行深入研究有助于对其更好地进行干预。在动脉粥样硬化研究中，越来越多的研究表明脂质沉积及氧化应激诱导的持续炎症反应在粥样硬化的发生发展中扮演着重要的角色[8]，研究者常常更关注动脉粥样硬化的主要病理改变，即泡沫细胞、胆固醇核心的形成以及纤维帽的厚薄，这些与巨噬细胞和平滑肌细胞的病理反应关系密切，而血管内皮细胞作为保护血管的第一道屏障在动脉粥样硬化的形成中更是具有核心地位[9]。

生理状况下，血管内皮通过缝隙连接、紧密连接及粘附连接形成单层细胞结构。正常情况下内皮细胞通过穿胞机制及细胞间隙允许一些小分子和液体等穿过，循环中清蛋白、LDL等不易透过内皮屏障。在高血脂、高血压、吸烟等诱因下，循环中LDL不断地通过脂氧合酶及髓过氧化物酶等途径形成Ox-LDL[10]。资料表明，相较于LDL，Ox-LDL在动脉粥样硬化病变的发生发展中起着更为关键的作用[11]。Ox-LDL颗粒的受体不具有下调功能，从而造成脂质的过度沉积，同时吞噬的脂质不能在细胞内完全降解，可促使炎症反应激活和内皮细胞等血管壁细胞的应激及损害。Ox-LDL经LOX-1途径损害内皮屏障功能，导致脂质向内皮下浸润并增加脂质穿胞作用，进而导致内皮细胞生存状态恶化是动脉粥样硬化及相关损害的关键因素[12-13]。循环中的Ox-LDL约占循环中LDL的10%左右。Ox-LDL可以通过内皮细胞表面LOX-1受体在血管内皮细胞中沉积并引起一系列不良后果[14]。

本研究结果显示P210抗体干预可以减轻内皮细胞内脂质沉积，使促凋亡蛋白Bax表达相对减少、抗凋亡蛋白Bcl-2表达相对增多，抑制内皮细胞死亡，从而保护内皮屏障功能。本研究还发现P210抗体可以增加内皮紧密连接蛋白ZO-1表达，减少内皮连接屏障的破坏，从而减少Ox-LDL在内皮细胞下沉积，减轻内皮细胞生理功能的损伤。因此，我们认为，P210抗体可以减少氧化脂质在内皮细胞下沉积，减少内皮细胞凋亡，保护内皮屏障，从而发挥抗动脉粥样硬化作用。

我们的研究尚存在许多不足之处，后续的实验需要利用ApoE基因和LOX-1基因敲除小鼠进行更细致完善的探索和验证。我们认为，以免疫干预的方式对动脉粥样硬化病变的初始环节进行干预是一个很有前景的研究方向。

综上所述，针对氧化脂质特异性抗原表位的P210抗体可以减轻氧化脂质在内皮细胞内的沉积，减少内皮细胞的损伤，保护内皮连接蛋白的正常表达从而维持内皮屏障完整性，从初始环节减轻动脉粥样硬化的发展，但其具体机制还需进一步的深入研究。