姜黄素对糖尿病肾病小鼠肾损伤及肾纤维化的影响及其机制*

张少华， 张彦芳， 曹 萌， 李 燕， 廖立夏， 王贝贝

1河南省南阳市第一人民医院儿一科，南阳 4730002新乡医学院第一附属医院内分泌二病区，新乡 453100

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是2型糖尿病的并发症之一，是终末期肾病(end-stage renal disease，ESRD)的主要病因，具有较高的致死率，且缺乏有效诊断指标[1]。姜黄素(curcumin，Cur)是提取自姜黄根状茎的主要活性成分。Cur具有抗肿瘤[2]、抗氧化[3]、抗炎[3]、降脂和降血糖的作用[4]。相关研究表明Cur对神经根疼痛[5]、肾病[3]、视网膜病变[6]、血管疾病[7]和胰腺疾病[8]均具有一定的治疗作用。TGF-β1/p38MAPK信号减弱被认为是抑制DN的途径之一[9]，且研究表明TGF-β1/p38MAPK信号激活可诱导急性肾损伤和肾纤维化，由此推测，抑制该通路可能是治疗DN的有效策略。Cur对DN的改善作用已有报道[10]，但Cur是否通过负调控TGF-β1/p38MAPK信号从而减轻DN肾损伤还未见报道。本文旨在进一步研究Cur改善DN的分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

Cur购自美国Selleck公司，分子量368.38，纯度99.83%。苏木精-伊红(HE)染色液、RIPA裂解液及BCA试剂盒购自北京索莱宝生物科技公司。尿蛋白、血尿酸(uric acid)、血肌酐(serum creatinine，Scr)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。TUNEL试剂盒购自瑞士罗氏生物公司。Collagen Ⅳ、fibronectin、TGF-β1、cleaved Caspase-3、p38MAPK一抗均购自英国Abcam公司，免疫组化用TGF-β一抗购自美国赛默飞世尔公司。

1.2 实验动物分组及处理

30只6～8周龄健康清洁级雄性C57BLKS/J小鼠(db/m)，体质量20～30 g，另外30只相同周龄糖尿病(db/db)小鼠，体质量35～45 g，购自北京维通利华实验动物公司。实验小鼠饲养在医院实验中心动物房。所有小鼠均自由进食，光暗循环12/12 h，室温25～27 ℃，湿度60%。将正常小鼠作为对照组(db/m组)；将糖尿病(db/db)小鼠分为模型组(db/db组)和姜黄素组(db/db+Cur组)。姜黄素组小鼠灌胃给予200 mg/kg·d的Cur，对照组和模型组小鼠灌胃给予等量生理盐水。连续给药12周后进行相应检测。

1.3 样品准备

给药12周后，用代谢笼收集实验小鼠的24 h尿液，麻醉小鼠，取血，收集血清，严格按照试剂盒说明书测定Scr、尿酸和尿蛋白浓度。随后打开腹腔，摘取一侧肾脏，以4%中性多聚甲醛固定，石蜡包埋，制作4 μm厚度的切片；取另一侧肾脏称重，剪成小块并加入液氮研磨成粉末，立即用RIPA溶液提取蛋白，待用。

1.4 组织切片苏木精-伊红(HE)染色

肾脏石蜡切片以二甲苯脱蜡，每次5 min；梯度乙醇水化，每次3 min；二甲苯进行脱蜡、水化，根据HE染色液说明书对切片进行染色，在显微镜下观察肾脏组织并拍照。

1.5 TUNEL检测细胞凋亡情况

取肾脏石蜡切片进行脱蜡、水化，以Proteinase K工作液在25℃消化组织15 min，PBS漂洗，按照说明书对切片进行TUNEL染色，显微镜下观察并计算细胞凋亡率。200倍光镜下计数凋亡细胞(棕黄色)，每组选取互不连接的10个视野计算细胞凋亡率，细胞凋亡率(%)=(TUNEL阳性细胞数/细胞总数)×100%。

1.6 免疫组化检测肾脏组织TGF-β的表达

取石蜡切片进行脱蜡、水化后高压抗原热修复。切片经过封闭后进行以TGF-β抗体(1∶100)在4 ℃孵育过夜，洗涤后以二抗在37℃孵育1 h，洗涤后DAB显色。TGF-β阳性表达为细胞膜和(或)细胞质中出现深棕色的颗粒，显微镜下每张切片随机选取5个视野并摄像保存，采用Image Pro Plus软件设置阳性表达的宏程序，在同一条件下，分析不同组别的TGF-β表达量。

1.7 氧化应激标志物检测

取新鲜肾脏组织根据试剂盒说明书测定肾组织MDA、SOD和LDH的浓度。

1.8 免疫印迹法检测蛋白表达

提取的肾脏组织蛋白定量后以12% SDS-PAGE电泳，PVDF膜转移，TBST漂洗2次，室温条件下于5%脱脂奶粉中封闭2 h，一抗4 ℃孵育过夜。次日，TBST漂洗膜3次，加入二抗，室温下孵育2 h，滴加ECL化学发光液，显像分析。以GAPDH作为内参。

1.9 统计学分析

采用GraphPad Prism 5软件对实验结果进行统计学分析，计数资料以“均数±标准差”表示，两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Cur改善db/db小鼠肾脏功能及肾脏病理损伤

如图1所示，与对照组比较，模型组小鼠尿蛋白含量、血尿酸和血肌酐浓度显著升高(均P<0.01)；与模型组比较，姜黄素组小鼠尿蛋白含量、血尿酸和血肌酐浓度显著降低(均P<0.01)。此外，如图2A所示，与对照组比较，模型组肾小球体积增大，肾小管上皮细胞水肿、脱落，系膜区增宽，系膜细胞增生；与模型组比较，姜黄素组肾小管上皮细胞趋于正常，肾小球和系膜细胞相对减少。HE染色表明Cur能改善db/db小鼠肾脏病理损伤。

1：对照组；2：模型组；3：姜黄素组；与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01

2.2 Cur减少db/db小鼠肾脏细胞凋亡

TUNEL染色(图2B)显示，与对照组比较，模型组细胞凋亡率(棕色阳性细胞比率)明显上升(P<0.01)，而Cur治疗后，姜黄素组细胞凋亡率明显下降(P<0.01)。Western blot结果如图2C，模型组cleaved Caspase-3表达明显上调，而姜黄素组cleaved Caspase-3表达显著下降。

A：HE染色检测肾组织病理损伤；B：TUNEL染色检测细胞凋亡；C：Western blot检测cleaved Caspase-3蛋白表达水平；1：对照组；2：模型组；3：姜黄素组；与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01

2.3 Cur减弱db/db小鼠肾纤维化

TGF-β免疫组化结果(图3A)显示，与对照组相比，模型组TGF-β表达阳性细胞明显增多(P<0.01)，Cur显著下调姜黄素组小鼠肾脏组织TGF-β表达(P<0.01)。Collagen Ⅳ和fibronectin在模型组小鼠肾脏中表达升高，而Cur可显著抑制姜黄素组此两种蛋白的表达(图3B)。

A：免疫组化检测肾脏组织TGF-β表达；B：Western blot检测Collagen Ⅳ和fibronectin蛋白表达水平；1：对照组；2：模型组；3：姜黄素组；与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01

2.4 Cur减弱db/db小鼠氧化应激损伤

如图4所示，与对照组比较，模型组肾脏组织中LDH和MDA水平明显升高，SOD水平显著下降(均P<0.01)；Cur显著降低姜黄素组小鼠肾脏组织中LDH和MDA水平，增加SOD水平(均P<0.01)。

1：对照组；2：模型组；3：姜黄素组；与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01

2.5 Cur抑制db/db小鼠TGF-β1/p38MAPK信号

如图5所示，在模型组小鼠肾脏组织中，p38MAPK磷酸化水平和TGF-β1表达水平明显升高，Cur可减少p38MAPK磷酸化水平和TGF-β1表达水平，说明Cur抑制db/db小鼠肾脏组织中TGF-β1/p38MAPK信号。

1：对照组；2：模型组；3：姜黄素组；与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01

3 讨论

DN是糖尿病的一种慢性并发症，其特点是肾小球系膜的扩张和细胞外基质(ECM)蛋白的过度积累，以及血流动力学的改变[11]。已有研究表明Cur具有肾保护和改善DN的功效。例如，Lu等[12-13]报告了Cur可以抑制炎性小体NLRP3从而减轻DN；Kim等[10]的研究表明Cur能抑制2型糖尿病大鼠氧化应激并调节脂质代谢。本研究中db/db小鼠肾小管出现蛋白积累，并出现明显的病理损伤，结合肾功标志物检测说明db/db小鼠产生了肾损伤，肾功能减弱,db/db小鼠可以作为DN疾病模型。研究表明，抑制细胞外基质的堆积可减缓肾纤维化进程[11]。本研究中Cur治疗后db/db小鼠肾组织Collagen Ⅳ和fibronectin表达水平显著降低，说明Cur可改善DN肾纤维化。且肾功标志物和细胞凋亡率明显降低，与上述文献一致，说明Cur可改善DN肾损伤。

在糖尿病条件下，高血糖可引起ROS的产生和脂质过氧化，从而引发DN[14]。本研究发现Cur增加了组织SOD，同时降低了脂质过氧化物指标MDA含量。我们推测Cur可能通过抗氧化和凋亡减轻DN小鼠肾损伤。

p38MAPK通路在DN发生发展过程中可被多种应激因子激活，如高血糖[14]、血流动力学异常、氧化应激和促炎细胞因子[9]。p-p38作为p38MAPK通路中的关键信号分子，其表达增强是该信号通路激活的标志之一[15-16]。TGF-β1是成纤维细胞的趋化诱导因子，在DN中可促ECM(如fibronectin)产生[17]。p38MAPK的激活促进人类DN的恶化，并促进TGF-β1表达[18]。既往对DN患者及DN动物实验模型的研究表明，糖尿病和高糖环境可引起p38MAPK信号通路的激活[19]。陈亚利等[20]研究发现Cur可通过下调高尿酸血症大鼠肾脏组织中TGF-β1的表达而发挥肾脏保护作用。董墨妍等[21]研究发现Cur通过抑制p38MAPK信号通路的磷酸化对DN具有治疗作用。与上述文献一致，本文研究表明db/db小鼠中p-p38和TGF-β1表达增加，同时Cur可抑制p-p38和TGF-β1表达，提示Cur可抑制TGF-β1/p38MAPK信号激活，进而减轻db/db小鼠DN肾损伤。

综上所述，Cur可减弱DN db/db小鼠肾损伤和肾纤维化，其机制可能是减少氧化应激和细胞凋亡；且其分子机制可能与TGF-β1/p38MAPK信号通路的抑制有关。