酶免试剂的灰区设置在无偿献血中应用的必要性探讨

张燕，陈明军，吕永磊，金新莉，方建华，李建斌

（河南省红十字血液中心，河南 郑州450000）

酶联免疫吸附试验（ELISA，enzyme-linked immunosorbent assay） 是国内血站筛查实验室检测HBsAg、抗-HCV、HIV 和抗-TP 的最常用的方法[1]。为了防止弱阳性标本漏检,最大限度的确保血液安全,很多实验室按照试剂说明书要求临界值的0.5~0.9 倍设置自己实验室的临界值[2]，即所谓的“灰区”。我们实验室也不例外，ELISA 检测所用8 种试剂的临界值定为0.7 倍cutoff，即检测值(S/CO)大于或等于0.7 的标本判定为不合格。随着血站系统检测试剂灵敏度的不断提高和核酸检测的全覆盖，ELISA 检测“灰区”的存在是否还有必要，本文通过对ELISA 四项的血清盘进行检测，分析灰区设置的必要性。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 乙肝表面抗原检测试剂盒 (1--23081、2--23043) ，丙肝抗体检测试剂盒 (1--23081、2--23001) ，人类免疫缺陷病毒抗体检测试剂盒( 1--23081) ，人类免疫缺陷病毒抗原/抗体检测试剂盒( 2--23089) ，梅毒螺旋体抗体检测试剂盒( 1--23081、2--23043)。Microlab STAR 全自动样本处理系统 ( 瑞士哈美顿) ，Microlab FAME 全自动酶免分析仪( 瑞士哈美顿)，Sunrise 酶标仪( 瑞士帝肯) 等。质控品为酶免四项混合质控，来源于北京康彻思坦生物有限公司。

1.2 血清盘的来源与构成 血清盘来源于国家卫健委临检中心，2017 年11 月份到12 月份，我们实验室参加了卫健委临检中心组织的多中心评估活动，全国21 家血液中心和中心血站参与，包括7家发光系统和6 家酶免试剂，其中HBsAg 共有9个血清盘，共计792 个标本，包括423 个真阳性+质控76 个+特殊设计样本97 个+不确定 8 个+真阴性 188 个；抗-HCV 共 8 个血清盘，共计 704 个标本，包括真阳性318 个+质控128 个+真阴性155个+103 个不确定；HIV 共 4 个血清盘，共计 330 个标本，包括149 个真阳性+质控76 个+5 个不确定+78 个真阴性标本；抗-TP 共7 个血清盘，共计616个标本，包括373 个真阳性+质控84 个+特殊样本11 个+不确定 18 个+真阴性 130 个。

1.3 血清盘的判定规则 国家卫健委临检中心使用8 种ELISA 试剂和7 种化学发光试剂对血清盘结果进行确认，所有试剂结果均为反应性的标本判定为真阳性，反之则判定为真阴性。结果不一致时采用确证实验，其中HBV 采用中和实验（罗氏、雅培、索林）、核酸和“两对半”；HCV 采用 RIBA 和核酸实验；HIV 采用WB 和核酸实验；TP 采用TPPA 和RIBA。确定实验和核酸检测均为反应性时判定为真阳性，反之则判定为真阴性，两者结果不一致时判定为不确定。本文中纳入统计结果的标本为真阳性和真阴性标本。

1.4 灰区设置 本实验室所用8 种ELISA 试剂的灰区设置为0.7～1.0，即S/CO≥0.7 判定为有反应性；S/CO＜0.7 判定为无反应性。

1.5 统计方法 将检测结果与最终判定结果比较，计算各试剂的检测灵敏度 （检测为真阳性数量/确证为真阳性数量×100%）、检测特异性（检测为真阴性数量/确证为真阴性数量×100%）、约登指数（为灵敏度+特异性）-1。统计工具采用2010 版EXCEL。

2 结果

2.1 两种HBsAg ELISA 试剂结果分析 纳入统计的HBV 标本共计611 例，见表1。从结果来看，两种HBsAg ELISA 存在一定比例的假阴性标本。而我实验室设置的临界值0.7 和试剂说明书上临界值为1，就灵敏度、特异性和约登指数来看，没有明显差异。

表1 两种HBsAgELISA结果分析

2.2 两种抗-HCV ELISA 试剂结果分析 纳入统计的HCV 标本共计473 例，见表2。从结果来看，两种抗-HCV ELISA 试剂的灵敏度与临界值为0.7和1 时没有明显差异，但是两种试剂的特异性在临界值为1 时有显著提高。

表2 两种抗-HCVELISA结果分析

2.3 两种HIV ELISA 试剂结果分析 纳入统计的HIV 标本共计 227 例，见表3。从结果来看，进口试剂灵敏度为100%，而特异性在临界值为1 时提高到92.3%； 国产试剂在灵敏度稍低于进口试剂，特异性在临界值为1 时也有所提高。

表3 两种HIVELISA结果分析

2.4 两种抗-TP ELISA 试剂结果分析 纳入统计的TP 标本共计 503 例，见表4。从结果来看，两种ELISA 试剂的灵敏度都大于99%，但都存在一定比例的假阳性，不设置灰区时特异性有所提高。

表4 两种抗-TPELISA结果分析

2.5 8 种ELISA 试剂最佳临界值的确定 图1 为7种国产ELISA 试剂的临界值从0.05～1.2 时的约登指数，图2 为 1 种进口ELISA 试剂的临界值从0.4～1.2 时的约登指数。表5 为各试剂在最大约登指数下的灵敏度和特异性和S/CO。从结果来看，两种HBsAg 试剂的最佳临界值分别为0.3 和0.2，另外6 种ELISA 试剂的最佳临界值为1～1.2。

3 讨论

图1 7 种国产ELISA试剂不同临界点（S/CO值）下的约登指数

图2 1 种进口ELISA试剂不同临界点（S/CO值）下的约登指数

表5 各试剂最大约登指数下的S/CO值及其灵敏度和特异性

据文献报道，不同的试剂盒其包被抗原的来源、纯度、包被工艺及包被量等都存在差异，使得不同的试剂盒对不同片段的抗原或抗体的反应不同，同时加上不同方法学所受的干扰不同，从而出现不同的试剂盒对同一标本的测定结果有可能不同，导致实验中不同的试剂筛查结果有差异[3]。

WHO 输血传播感染筛查策略明确指出血液检测筛查方法应具有较高的灵敏度和足够的特异性，避免由于非特异结果给献血者带来不必要的淘汰。灰区设置应本着必要及合理，不能过度的强调试剂灵敏度而忽略特异性，从而影响试验的总体性能。再者，如今血液的采集和临床供应短缺已成为常态化，血液资源更显得有限和宝贵，如果血站实验室灰区设置不合理，势必造成一定血液资源的浪费；也会造成献血者流失[4]。

近年来，血站系统很多实验室对所用试剂进行灰区设置的探讨[5-9]，通过对灰区标本进行确证实验和灰区献血者进行追踪，结论不尽相同。我们实验室通过对血清盘结果进行分析，比较设置灰区和不设灰区两种情况下八种ELISA 试剂的灵敏度、特异性和约登指数。

血清盘的检测结果表明，两种HBsAg 试剂灰区设置为S/CO=0.7 时灵敏度为84.6%和79.4%，特异性为95.7%和97.3%，不设灰区时为S/CO=1时灵敏度为82.3%和76.8%，特异性为97.9%和98.4%。我们所用两种HBsAg 试剂对血清盘的检测中均存在一定比例的假阴性标本。抗-HCV 试剂1和试剂2 灰区设置为S/CO=0.7 时灵敏度为99.7和99.1%，特异性为88.4%和92.9%，临界值S/CO=1 时灵敏度为99.7%和99.7%，特异性为92.9%和93.5%。不设置灰区时灵敏度和特异性相比设置灰区时灵敏度和特异性有所提高。HIV 试剂1 和试剂2 灰区设置为S/CO=0.7 时和不设灰区时为S/CO=1时灵敏度是一致的，特异度在S/CO=1 时有所提高，特别是HIV 试剂2 的灵敏度为100%，特异性在取消灰区设置后为92.3%。HIV 试剂1 的特异性在取消灰区设置后也提高到97.4%。抗-TP 试剂1和试剂2 的灵敏度和特异性灰区存在与否时基本一致，灵敏度为99.7%，特异性为82.8%~88.2%，存在一定的假阳性标本，且大部分假阳性标本的S/CO＞1。由此可知，HBsAg 试剂有必要设置灰区，并需要提高试剂的灵敏度，而抗-HCV、HIV 和抗-TP ELISA 试剂取消灰区设置。

本文参照文献[10]中的方法，计算在不同S/CO值下试剂的灵敏度、 特异性及约登指数，约登指数=（灵敏度+特异度）-1，以 S/CO 值为横坐标，约登指数为纵坐标，绘制曲线，观察每种试剂在最大约登指数下的S/CO 值。8 种ELISA 试剂最佳临界值分别为 HBsAg 试剂的最佳临界值为0.2~0.3，抗-HCV 试剂的最佳临界值为1，HIV 试剂的最佳临界值为1~1.2，抗-TP 试剂的最佳临界值为1~1.1。这与文献[10-14]中的结果基本一致，国产HBsAg ELISA 试剂的阳性判定值为0.3，进口试剂设为0.6。11 家血站实验室的抗-TP ELISA 试剂的结果支持取消灰区设置；关于抗-HCV 试剂灰区设置的近三年的文献支持取消灰区设置； 对HIV 近五年灰区标本的分析结果也支持取消灰区设置。

京津冀[15]15 家血站实验室ELISA 灰区设定调查结果显示，除1 家血液中心，其他实验室均设置了 ELISA 检测灰区，主要集中在 0.7~0.85 之间。笔者认为ELISA 灰区是实验室为更大限度检测出阳性标本而设定的，它能够降低因漏检而带来的风险，但也不可避免地淘汰一部分合格的血液。再者，ELISA 方法出现灰区除了病毒窗口期的原因还有很多因素，例如：病毒基因变异、钩状效应、试剂因素、人为因素[16]。

综上，灰区设置应遵循科学性、严谨性和系统性。本文主要对血清盘的结果进行灰区设置合理性的分析，目前我们实验室针对HBsAg 血清盘的结果做了详细分析[17]，结果和本文一致。还需要补充无偿献血者的样本的结果分析，下一步会进行确证实验和结果分析，进一步探讨ELISA 灰区设置的意义。