改良有效的培养大鼠原代血管平滑肌细胞的方法

邓惠坚 ，卢群 ，林转娣 审校

（1.广州市番禺区中心医院；2.广东药科大学；3.广州市番禺区中心医院，广州 番禺 511400）

高血压是心脑血管疾病最重要的危险因素之一，长期的血压升高促进动脉管壁发生弥漫性纤维性硬化，最终导致心、脑及肾等靶器官损害[1]。在动脉粥样硬化的发生发展过程，VSMCs 参与了动脉壁生理功能和病理变化[2,3]。当血管内皮细胞功能受损后，内皮细胞合成及分泌的血管活性物质与细胞因子间的平衡会被破坏，导致白细胞黏附，诱导 VSMCs 发生表型转化并迁移到内膜下[4]。活化的 VSMCs 大量增殖并摄取氧化型低密度脂蛋白形成泡沫细胞，大量泡沫细胞堆积会引发动脉粥样硬化的形成及病理性内膜增厚[5,6]。高血压、超重/肥胖和吸烟是导致AS 发生的主要三种危险因素，本实验是利用的高血压和导致肥胖的高脂饮食的危险因素促进AS 模型的快速构建，而动脉粥样硬化形成的血管平滑肌细胞增强的增殖和迁移能力将有助于细胞培养。

1 材料与方法

1.1 材料

⑴实验动物 10 周龄雄性SPF 级自发性高血压大鼠和10 周龄的SD 大鼠各 12 只，体重（230±15）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

⑵饲料 高脂高胆固醇饲料 （配方：4% 胆固醇，0.5% 胆酸钠，0.2% 丙基硫氧嘧啶，10%猪油，5% 白糖，80.3% 普通饲料）。

⑶实验仪器 超净工作台（SW-CJ-2F，苏净集团安泰公司）SHEL L/JB CO2培养箱 （Heraeus，德国）倒置荧光显微镜（Olympus，Tokyo，Japan）病理切片设备 全自动生化分析仪（美国亚培公司）。

⑷实验试剂 胎牛血清(Gibco 公司) 青霉素和链霉素（吉诺生物有限公司）高糖培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM, Gibco 公司)磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline, PBS) 4%多聚甲醛（广州翔博） 4',6-二脒基-2-苯基吲哚染色液(4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI, 碧云天公司） 抗α 平滑肌肌动蛋白抗体 (alpha smooth muscle actin, α-SMA, Abcam） 荧光二抗 (R&D) 维生素D3 注射液 （上海通用药业公司） 10% 水合氯醛（广东药科大学附属第一医院）

1.2 方法

⑴12 只 10 周龄自发性高血压大鼠（雄性）。高脂高胆固醇饲料喂养3 周，在饲养开始时，每只大鼠予以 60 万/U 维生素D3 腹腔注射，平均分 2 d注射完毕。同时SD 大鼠采取普通饲料喂养 3 周。

⑵3 周后大鼠称重后通过用 10% 水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉，然后用 75% 医用乙醇浸泡大鼠颈部以下的部位，消毒时间 2 min。接着操作者带好无菌手套和穿好无菌隔离衣，在消毒操作台用镊子和剪刀采用“D”字形切口打开左侧胸腔并分离出大鼠胸主动脉，立即放入含有 1%青霉素和链霉素的 4℃ 预冷的无菌PBS 溶液中，反复冲洗血管直至血管透亮。

⑶一部分血管用于转移到 4% 多聚甲醛固定液中后行HE 染色后观察血管内膜形态改变。另一部分血管放置于含20% 胎牛血清和 1% 青霉素、链霉素的DMEM 培养液中，用小剪刀纵向剖开血管并使内膜面朝上，用两个眼科弯镊背侧摊平血管并轻轻搔刮血管内膜面，以便刮除血管内膜上的内皮细胞。接着，用两个眼科弯镊背侧压紧血管内膜面反向牵拉，使得内膜面中层组织撕裂，镊子背侧继续轻轻剥离血管中层组织并充分剔除外膜组织。将取好的中层组织置入小离心管内，眼科小剪刀将组织剪成约1mm3的组织粒。用移液枪吸干组织粒间的水分后并将剪碎的组织块均匀贴放于25cm2培养瓶底，组织粒间距约 0.2~0.3cm。最后把培养瓶置于直立或者倒立状态，并向瓶内加入2~3ml 含 20% 胎牛血清和 1% 青霉素、 链霉素的DMEM 培养液，置于 37℃、5% CO2培养箱中，继续保持直立或倒立状态保持 1.5~3h，根据组织块与瓶壁牢固贴附情况调整时间。后轻轻地翻转培养瓶使组织块浸没于培养液中。

⑷培养瓶静置培养箱 3d 后取出观察，用含20% 胎牛血清和 1% 青霉素、链霉素的DMEM 培养液以保留原培养基量的 1/2~1/3 方式来换液处理。约 5~7d 后在显微镜下可见细胞从组织块边缘爬出，往后约 2d 换液 1 次，具体可以根据培养基的颜色变化调整换液时间。

⑸传代培养： 当组织粒间的细胞生长汇合达80% 以上时可进行第一次传代处理，在超净工作台中用常温无菌的PBS 溶液冲洗组织粒使之脱落，再加入 0.125% 胰酶混合消化液 2ml。室温下消化约1min 后置于显微镜下观察，当发现细胞回缩、间隙增大并有少数细胞脱落时，直接加入 2ml的20%胎牛血清的DMEM 培养液来终止消化，移液枪吹打瓶壁细胞使之脱落混匀并制成单细胞悬液，然后将细胞悬液转移至 5ml 的无菌离心管，离心管密封后于台式离心机 1000r/min 的参数下离心5 min 后超净工作台中吸去上清液，接着加入含20% 胎牛血清的DMEM 培养液后混匀并制成单细胞悬液，以 1:3 原则接种传代，细胞个数控制在约 1×106个/ml。将传代的培养瓶做好标志后放入37℃、5% 的 CO2培养箱中培养，约 3 d 可长满。建议前 3 代的平滑肌细胞培养选用含 20% 胎牛血清的DMEM 培养液，往后的细胞可选用含 10% 胎牛血清的DMEM 培养液。

⑹通过在倒置相差显微镜下观察并拍照记录平滑肌细胞的生长特点、大小、形态及排列方式等。

⑺平滑肌细胞鉴定： 本次实验用免疫荧光化学法对第 3 代血管平滑肌细胞进行鉴定，将制好的细胞悬液注入到预先放置盖玻片的 6 孔板中，待细胞生长汇合达 80% 以上时，吸去孔板中的培养液后加入适量的 4% 多聚甲醛，并置于室温下固定 20~30 min，用PBS 漂洗盖玻片 3 次，每次时间约 5 min。然后用 1 % TritonX-100 通透细胞膜处理，时间20~30 min。接着再加入山羊血清覆盖盖玻片并置于 37℃ 下封闭处理，时间 60 min。封闭结束后用PBS 漂洗盖玻片 3 次，每次时间约 5 min。加入一抗(α-SMA 1：200) 稀释液孵育并置于4℃ 冰箱过夜。隔天再用PBS 漂洗盖玻片 3 次，每次时间约 5 min。暗室内加入FITC 标记的山羊抗鼠抗体稀释液孵育盖玻片，继续置于室温下暗室60 min。孵育结束后PBS 液继续漂洗 3 次，每次时间 5 min。最后加入含 1 μg/ml 的 DAPI 的 PBS 稀释液暗室下继续孵育 10 min，用PBS 液充分冲洗盖玻片，甘油封片后在倒置荧光显微镜下观察并摄片记录。

2 结果

⑴图a 中高倍显微镜镜下（100 x）可见自发性高血压大鼠胸主动脉内膜有不同程度的内皮细胞脱落，且血管中层组织可见平滑肌细胞大量增殖和迁移导致内膜动脉病理性增生。见图 b 中高倍显微镜镜下（100 x）SD 大鼠动脉内膜未见增厚，且血管内膜下内皮细胞排列整齐。

⑵原代血管平滑肌细胞的鉴定结果。低倍镜下（40 x）可见平滑肌细胞呈典型的峰谷样生长形态（如图A），高倍镜下（100 x）观察到细胞长梭形样的生长形态,见图B。图C 显示是荧光显微镜下的平滑肌细胞，显色为绿色是平滑肌细胞细胞质中的肌动蛋白，蓝色的是平滑肌细胞的细胞核。本实验成功获取大鼠的原代血管平滑肌细胞。见图D 显示是本次实验的杂细胞-血管内皮细胞。

⑶两组大鼠原代血管平滑肌细胞的数据对比。

3 讨论

在高血压大鼠动物研究中发现，大鼠体内的动脉的内膜厚度较正常大鼠明显增厚,其机制可能与高血压改变血管平滑肌细胞的表型状态有关[7,8]。本实验选用自发性高血压大鼠与SD 大鼠血管培养血管平滑肌细胞，结果显示自发性高血压大鼠实验组大鼠组细胞生长速度更快，而且细胞生长状态良好。内膜下的脂质沉积也是AS 的基础病变之一，可以通过诱导大量炎性细胞浸润促进内膜灶状纤维化及粥样斑块形成[9,10]。研究发现大剂量的维生素D3 可以通过损伤血管内皮细胞促进血管钙化从而导致动脉粥样硬化形成[11]。本次研究我们采用腹腔注射大剂量的维生素D3 来达到损伤血管的内皮细胞，然后喂养3 周的高脂高胆固醇饲料，通过病理切片我们可以看到有效快速地建立起动脉粥样硬化模型。本实验结果显示自发性高血压大鼠血管培养出的平滑肌细胞纯度更高，避免了内皮细胞的生长干预了平滑肌细胞培养。本实验首次比较动脉粥样硬化形成自发性高血压大鼠与SD 大鼠胸主动脉平滑肌细胞贴壁培养的生长状态，结果显示选取动脉粥样硬化形成的自发性高血压大鼠更容易培养出纯度更高的原代血管平滑肌细胞。

表1

在培养原代大鼠血管平滑肌细胞过程中往往涉及很多细节，以下总结几点：⑴相对无菌的操作过程是成功的基础；包括使用大鼠解剖前的消毒、器械的高压灭菌、超净工作台的准备、带有双抗的漂洗液、 无菌手套的使用等等。⑵操作时间的控制；血管是一个离体组织，整个血管中层组织的提取时间尽量控制在30~60min 内，前期的研究基础显示少于30min 的时间使得细胞的成功率更高。⑶血管活性的保持； 本次实验过程用到的漂洗液或者浸泡液要在 4℃ 冰箱预冷，操作工程尽量在预先准备好的冰袋上进行。⑷培养基的营养支持；细胞因子与活性物质是血管平滑肌细胞增殖与迁移的启动因子。因此，培养基必须要选用好的新鲜的血清或者加入血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor-BB, PDGF-BB）[12]。这里推荐使用新鲜的澳洲胎牛血清，血清尽量在解冻后1 月内用完，最好当天解冻后使用。⑸组织的处理；要用镊子轻轻刮血管内膜面及充分剔除血管外膜，避免后期的杂细胞的产生；将中膜层血管组织转移到小离心管内，可以快速充分剪碎组织粒，并且建议用微量的无菌移液枪将组织粒水分吸干以便缩短贴壁时间。⑹第一次换液的时间；培养箱中静置培养3~4 d 后，必须行第一次换液处理，以保留原培养基 1/2~1/3 量的方式来进行换液。一方面补充损耗的营养物质，另一方面保留部分原有的血管活性物质和细胞因子。