紫茎泽兰栽培平菇的毒理学研究

朱建义，杨洁淼，赵浩宇，刘胜男，黄静，周小刚*

(1.四川省农业科学院 植物保护研究所，四川 成都 610066；2.农业部西南作物有害生物综合治理重点试验室，四川 成都 610066；3.金堂县农业产业发展服务中心，四川 金堂 610400)

随着食用菌产业的大力发展，食用菌栽培原料面临资源短缺、价格高涨等问题，寻找新型培养基质迫在眉睫[1]。平菇是我国栽培量和消费量最大的食用菌之一，随着平菇生产规模逐年扩大，培养基质日趋紧张，新型培养基质的研究相继开展，范围涵盖果实、中药材、木材、菌糠或菌渣、外来植物等[2]。陈若霞等[3]利用加拿大一枝黄花，周浩等[4]以大米草作为主料栽培平菇，陈谦等[5]研究了紫茎泽兰对平菇产量及营养成分的影响。紫茎泽兰(EupatoriumadenophorumSpreng)是一种入侵性恶性杂草，其营养丰富，是生产食用菌的优质原料[6-7]。利用其栽培食用菌，一方面为食用菌生产提供成本低廉、原料丰富的培养料，同时又可有效控制杂草危害，具有较好的生态、经济和社会效益。紫茎泽兰是一种含有有毒物质的有害杂草[8]，利用其栽培平菇是否存在毒性残留和富集的安全性问题，目前鲜有报道。明确利用紫茎泽兰栽培平菇的安全性，可为新型基质紫茎泽兰的系统研究提供参考和依据。本研究使用紫茎泽兰栽培平菇，并进行毒理学研究，以明确其是否具有安全隐患。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品及菌种

紫茎泽兰采自四川省西昌市；平菇杂优1号，由四川省农业科学院土壤肥料研究所提供；昆明种小白鼠，体重18～22 g，由山东大学试验动物中心提供[试验动物许可证号：SCXK(鲁)20130009号]。

1.1.2 培养基

PDA培养基：马铃薯200 g,葡萄糖20 g, 水1 000 mL。

常规平菇培养基：玉米芯70%，稻草10%，米糠10%，玉米粉7%，尿素0.5%，磷粉1%，石膏1.5%。

紫茎泽兰平菇培养基：紫茎泽兰42%，玉米芯28%，稻草10%，米糠10%，玉米粉7%，尿素0.5%，磷粉1%，石膏1.5%。

1.2 方法

1.2.1 紫茎泽兰前处理及栽培基质配制

取晒干的紫茎泽兰茎秆，粉碎成长度约5 mm的秸秆粉。先将紫茎泽兰秸秆粉、玉米芯用1∶500倍克霉灵溶液3～4 h湿透后，捞出与其他原料按比例混合均匀，再加水拌匀，料水质量比为1∶1.2～1.4，石灰先溶于水后取上清液加入，使pH达7.5～8.5。混匀，建堆，盖膜，待料温升至55 ℃时进行翻堆，一般情况翻堆1～2次即可，堆沤时间以15 d为宜。

1.2.2 出菇试验

按上述方法将栽培基质配制好后，装袋，套上颈圈，包扎袋口，100 ℃灭菌36 h，冷却后在无菌条件下接种平菇菌种。然后将菌袋置于培养室内，温度25～27 ℃，相对湿度85%。待菌丝长满菌袋，增加通风，控制温度18～20 ℃，打开袋口待子实体生长成熟时采集子实体。

1.2.3 毒理学试验

毒理学研究委托山东省职业卫生与职业病防治研究院进行。分别采集紫茎泽兰平菇(以下简称泽兰平菇)和普通平菇子实体，晒干或烘干后各取干品2 kg，进行小鼠经口急性毒性试验、小鼠30 d喂养试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核计数和小鼠精子畸形试验。

将泽兰平菇加工成粉末状，配成所需浓度。按照GB 15193.3—2003，采用最大限量法进行急性毒性试验方法。选健康小鼠20只，其中雌雄各10只。动物禁食12 h后称重分2次灌胃，灌胃体积按0.2 mL·kg-1体重计算，间隔6 h，剂量为15 000 mg·kg-1。动物给予受试物后连续观察14 d，记录动物中毒症状及死亡情况，最后根据动物死亡数量求出半数致死量(LD50)。

选健康小鼠50只，雌雄各半，适应性饲养3 d后，随机分为5组，每组10只：大剂量组(10 g·kg-1组)、中剂量组(5 g·kg-1组)、小剂量组(2.5 g·kg-1组)、普通平菇组(10 g·kg-1)及对照组。试验前将平菇粉掺入饲料中，加工成10%、5%、2.5%泽兰平菇小鼠饲料及10%普通平菇小鼠饲料，大剂量组给予10%泽兰平菇小鼠饲料，中剂量组给予5%泽兰平菇小鼠饲料，小剂量组给予2.5%泽兰平菇小鼠饲料，普通平菇组给予10%普通平菇小鼠饲料，对照组给予正常小鼠饲料，试验动物连续喂养30 d。动物喂养在SPF级动物房内进行。

试验期间每天观察记录小鼠的活动、进食情况及中毒症状，每周称量小鼠体重。试验结束时各组小鼠均采用摘眼球取血测定血液中白细胞总数(WBC)及分类(NEU、LYM)、红细胞总数(RBC)、血红蛋白含量(HGB)、血小板计数(PLT)、血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、血糖(GLU)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)的含量。并对全部动物进行解剖，检查脑、心、肺、肝、脾、肾、胃、肾上腺、睾丸、子宫等脏器情况，记录所见异常变化。取脑、心、肝、脾、肺、肾、睾丸、肾上腺等主要脏器称重，计算脏器系数(脏器重/体重×100%)。每组留取6只小鼠的主要脏器标本，用10%甲醛固定后，进行病理形态学检查。

选健康小鼠50只，雌雄各半，适应性饲养3 d后，随机分为5组，每组10只：泽兰平菇大剂量组、中剂量组、小剂量组及阴性对照组和阳性对照组。阴性对照组给予纯净水，阳性对照组给予40 mg·kg-1环磷酰胺腹腔注射。试验动物每日经口给药1次，连续2 d，于第2天给药后6 h处死动物，取两侧股骨骨髓，常规制片，Giemsa染色，镜下观察，每只动物观察10 000个嗜多染红细胞，求出微核率。

选健康雄性小鼠50只，随机分成5组，每组10只，试验处理及给药同上。给药后5 d脱臼处死动物，取出的双侧附睾置于盛有2 mL生理盐水的小烧杯中剪碎，4层擦镜纸过滤后制成精子悬液，进行精子计数、精子存活数和精子畸形检查。精子计数：取已制备好的精子悬液1滴灌入血细胞计数板的计数池中，高倍显微镜下计数池中5个中方格中的精子数，换算成1 mL精子悬液中的精子数即为每侧附睾的精子数量。精子畸形率：取已制备好的精子悬液以1 000 r·min-1离心5 min，吸去上清液，剩余少量液体与沉淀摇匀后，取悬液1滴置于洁净载玻片一侧，推片，晾干后甲醇固定5 min，干后用2%伊红水溶液染色1 h，在高倍显微镜下检查精子形态，每只鼠检查完整精子1 000个，计算畸形率。

1.3 数据分析

利用Excel 2010和DPS 7.05进行数据整理和统计分析。

2 结果与分析

2.1 小鼠经口急性毒性

小鼠经口给予15 000 mg·kg-1泽兰平菇后，动物出现静卧，饮食活动减少，8 h后逐渐恢复正常。连续观察14 d动物无死亡(表1)。结果表明，雌雄性小鼠经口急性毒性LD50>15 000 mg·kg-1，按照GB 15193.3—2003，泽兰平菇属无毒物质。

表1 不同小鼠性别的经口急性毒性

2.2 小鼠30 d喂养

试验各组血常规、血生化及脏器系数检查均未见异常(表3～5)。泽兰平菇大剂量组及普通平菇组小鼠喂养2周后被毛蓬松，体重增长缓慢，与对照组相比有显著性差异(表2)；小鼠解剖观察可见胃内容物较少，且呈黏液状；病理组织学检查胃黏膜细胞萎缩，黏膜层轻度变薄，炎细胞轻度增多，但未累及黏膜肌层。未见泽兰平菇有明显的毒性作用。

表2 不同级别小鼠喂养30 d的体重情况

表3 不同级别小鼠喂养30 d的血常规

表4 不同级别小鼠喂养30 d的血生化指标

表5 不同级别小鼠喂养30 d的脏器系数

2.3 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核计数

泽兰平菇各组微核率为0.17%～0.19%，阴性对照组为0.18%，泽兰平菇各组与阴性对照组均无显著性差异。而阳性对照组为1.94%，与阴性对照组相比有极显著差异(表6)。结果表明，在本试验条件下，泽兰平菇对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率无明显影响。

表6 紫茎泽兰对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率的影响

2.4 小鼠精子畸形率

泽兰平菇各组精子计数、精子存活率、精子畸形率与阴性对照组比较，均无显著性差异，而阳性对照组与阴性对照组相比有显著性差异(表7)。结果表明，在本试验条件下，泽兰平菇对小鼠精子畸形率无明显影响。

表7 紫茎泽兰对小鼠精子的影响

3 小结与结论

紫茎泽兰是一种含有毒物质的有害杂草，其主要有毒成分是佩兰毒素、泽兰苦内脂、香豆精类、丹宁等[8]。可引起大鼠肝脏毒性及血生化的改变[9-10]。紫茎泽兰醇提取物有一定胚胎毒性[11]。因此，利用紫茎泽兰栽培食用菌的食品安全性问题就显得至关重要。本研究结果显示，小鼠经口急性毒性LD50雌雄性动物均>15 000 mg·kg-1，按照GB 15193.3—2003进行急性毒性试验，泽兰平菇属无毒物质；小鼠30 d喂养试验各组血常规、血生化及脏器系数检查均未见异常；小鼠骨髓嗜多染红细胞微核和小鼠精子畸形试验结果均为阴性，表明泽兰平菇无致突变致畸作用。其原因可能是通过紫茎泽兰前处理、高温灭菌以及平菇自身含有的大量生物酶，将紫茎泽兰有毒物质降解，参与平菇生长的代谢过程，但其解毒机理有待深入研究。