硝化抑制剂与生物炭配施对水稻土氮素转化及氮肥利用率的影响

2021-05-18刘钰莹张妍汪哲远李廷强

浙江大学学报（农业与生命科学版） 2021年2期

刘钰莹，张妍，汪哲远，李廷强,2*

（1.浙江大学环境与资源学院，污染环境修复与生态健康教育部重点实验室，杭州310058；2.国家级环境与资源实验教学示范中心（浙江大学），杭州310058）

施用化学氮肥是促进水稻生长、提高产量的主要途径。但在稻田生态系统中，氮素能通过挥发、反硝化、径流、淋溶等多种途径损失，不仅降低氮肥利用率，也对生态环境带来潜在威胁[1]。因此，减少稻田氮素损失，提高氮肥利用效率并降低其环境风险，是现代农业生产迫切需要解决的问题。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试土壤为红壤发育的酸性水稻土（采自江西省吉安市）和潮土发育的中性水稻土（采自浙江省杭州市）。取耕层0～20 cm土壤，自然风干，磨细过4 mm尼龙网筛，其基本理化性质如表1所示。供试DMPP 纯度达97%，由浙江奥复托化工有限公司提供。供试生物炭为在300 ℃和500 ℃条件下制备的玉米秸秆生物炭（分别记为300BC和500BC），由南京三聚生物质新材料科技有限公司提供，其基本理化性质如表2所示。供试水稻品种为Ⅱ优023，由杭州市农业科学研究院提供。

1.2 试验设计

试验于2019 年5—9 月在浙江大学紫金港校区农业试验站玻璃温室内进行，光照为自然光。试验共设4 个处理:1）对照（CK）；2）DMPP；3）DMPP+300 ℃生物炭（DMPP+300BC）；4）DMPP+500 ℃生物炭（DMPP+500BC）。3 次重复，完全随机区组排列。采用口径为22 cm 的塑料桶进行盆栽试验，每盆装土10 kg。试验中氮（N）、磷（P2O5）、钾（K2O）的用量分别为1、0.4、0.46 g/盆，氮、磷、钾肥分别为尿素、过磷酸钙和氯化钾。所有肥料均作为基肥一次性均匀施入，DMPP 用量按对应处理尿素纯氮量的1%添加，与尿素混匀后施用，再分别添加8 L 去离子水，使土壤保持淹水泡田状态，平衡2 d后进行水稻移栽，每盆2株，并保持长期淹水管理。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 土壤氮素形态及反硝化活性测定

1.3.2 水稻收获与分析

水稻成熟后收获，实测每盆籽粒产量。采集各处理植株样，烘干，经H2SO4-HClO4消煮后，采用靛酚蓝比色法测定籽粒和秸秆中氮含量[15]。

1.3.3 土壤氨氧化微生物丰度分析

1.3.3.1 土壤总DNA提取

采用FastDNA SPIN 试剂盒（美国MP Biomedicals 公司）提取土壤总DNA，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。将提取的土壤总DNA 分管保存于－20 ℃冰箱中，备用。

1.3.3.2 实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）

氨氧化古菌（ammonia oxidizing archaea,AOA）和氨氧化细菌（ammonia oxidizing bacteria,AOB）基因丰度的定量PCR 扩增采用特异引物（表3）在LightCycler 480Ⅱ（瑞士Roche公司）仪器上进行。

荧光定量反应体系为10 μL，采用384孔板，包括DNA 模板0.5 μL，SYBR Green Premix ExTaq（日本TaKaRa公司）5 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各0.5 μL和灭菌超纯水3.5 μL。AOA 和AOB 的反应条件均为：95 ℃预变性60 s；95 ℃变性5 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，40 个循环。根据扩增循环阈值（CT）、已知质粒浓度和阿伏伽德罗常数计算AOA、AOB的amoA基因拷贝数。标准质粒在试验前以10倍梯度进行稀释，稀释倍数为101～108，每个样品重复3 次，同时做3 个空白对照组。用已知拷贝数的AOA和AOBamoA基因进行定量PCR扩增，得到标准曲线，产物的特异性通过熔解曲线进行验证。PCR扩增效率为90%～97%，曲线R2＞0.99。

表1 土壤基本理化性质Table 1 Basic physical and chemical properties of the soils

表2 不同生物炭的基本理化性质Table 2 Basic physical and chemical properties of different biochars

表3 用于PCR扩增的引物序列Table 3 Primer sequences for PCR amplification

1.4 数据分析

硝化抑制率/%=（A－B）/A×100.

式中：A为不添加硝化抑制剂处理的土壤培养后NO－3-N质量分数，mg/kg；B为添加硝化抑制剂处理的土壤培养后NO－3-N质量分数，mg/kg。

反硝化活性以每克土壤每小时生成的N2O微克数表示，参照PHILIPPOT等[14]的方法计算：

反硝化活性/（μg/（g•h））=（V×F×MN2O）/（VM×m×t）.式中：V为采样瓶顶空体积，L；F为测定的N2O质量浓度，μg/L；MN2O为N2O摩尔质量，44；VM为标况下摩尔体积，22.4；m为测定的土样质量，g；t为培养时间，h。

水稻氮肥利用率/%=（施肥后水稻收获时地上部的吸氮总量－未施肥水稻收获时地上部的吸氮总量）/化肥氮的投入量×100.

试验数据采用Origin 8.0 和SPSS 22.0 进行分析，采用邓肯新复极差检验法进行处理间的差异显著性分析，差异显著性水平设定为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 DMPP 与生物炭配施对水稻生物量和氮肥利用率的影响

与CK相比，在酸性水稻土中，无论是DMPP处理还是DMPP 配施生物炭处理，水稻秸秆生物量和籽粒产量都明显提高，但氮含量没有显著变化；而与DMPP 处理相比，配施生物炭对DMPP 在水稻生长及氮素吸收利用中的促进效果没有显著差异，且2种生物炭之间也没有明显变化（表4）。

对于中性水稻土而言，与CK 相比，单施DMPP和DMPP配施生物炭都能提高水稻秸秆生物量、籽粒产量和氮肥利用率；与单施DMPP相比，配施2种生物炭后水稻籽粒产量和氮含量都有明显增加，并能提高水稻氮肥利用率，尤其是配施500 ℃生物炭使中性水稻土中水稻籽粒产量和氮肥利用率的提升效果更显著，分别提高8.5%和10.6%（P＜0.05）（表4）。

2.2 DMPP与生物炭配施对水稻土氮素转化的影响

表4 DMPP配施生物炭对水稻生物量和氮肥利用率的影响Table 4 Effects of combined application of DMPP and biochar on rice biomass and nitrogen use efficiency

图1 DMPP配施生物炭对水稻土NH＋4-N和NO－3-N含量的影响Fig.1 Effects of combined application of DMPP and biochar on NH＋4-N and NO－3-N contents in paddy soils

2.3 DMPP 与生物炭配施对水稻土硝化抑制率的影响

2种水稻土中，与单施DMPP相比，配施生物炭能有效延长硝化抑制时长，可产生硝化抑制效果后移的现象，且以500 ℃生物炭配施对DMPP 的硝化抑制率提升效果更好（表5）。在酸性水稻土中，培养第7 天，配施生物炭处理的硝化抑制率与单施DMPP 相比略有降低；而到第21、42 天，配施500 ℃生物炭处理的硝化抑制率比单施DMPP处理分别提高18.0%和35.3%。在中性水稻土中，配施500 ℃生物炭对不同时期的硝化抑制率均有提升效果，在第7、21、42 天分别比单施DMPP 处理提高8.5%、22.2%、41.2%。总体而言，DMPP配施500 ℃生物炭对中性水稻土的硝化抑制效果优于酸性水稻土。

表5 DMPP配施生物炭对水稻土硝化抑制率的影响Table 5 Effects of combined application of DMPP and biochar on nitrification inhibition rate of paddy soils %

2.4 DMPP 与生物炭配施对水稻土反硝化活性的影响

酸性水稻土的反硝化活性总体上大于中性水稻土，尤其在水稻生长前期（图2）。对于酸性水稻土，与单施DMPP 相比，配施生物炭能显著降低土壤反硝化活性。水稻培养21 d，单施DMPP 处理的反硝化活性降低了17.3%，而配施300 ℃和500 ℃生物炭处理的反硝化活性分别降低了45.4%和80.9%（P＜0.05）。在处理后第42天，DMPP处理的反硝化活性与对照没有差异，而DMPP+500BC处理的反硝化活性显著降低，表明在酸性水稻土中DMPP 配施500 ℃生物炭能显著延长反硝化活性的抑制时长。对于中性水稻土，与单施DMPP相比，配施生物炭也能够增强其对土壤反硝化活性的抑制效果，但没有酸性水稻土明显。在处理后第42天，各处理之间没有显著差异，表明在中性水稻土中，配施生物炭并不能延长DMPP对反硝化活性的抑制时长。

图2 DMPP配施生物炭对水稻土反硝化活性的影响Fig.2 Effects of combined application of DMPP and biochar on denitrification activity of paddy soils

2.5 DMPP 与生物炭配施对水稻土氨氧化微生物的影响

图3 DMPP配施生物炭对水稻土氨氧化微生物丰度的影响Fig.3 Effects of combined application of DMPP and biochar on AOA and AOB abundance in paddy soils

3 讨论

DMPP的作用效果受土壤类型、有机质含量、水肥管理措施等因素的综合影响[18]。施用生物炭是改善土壤性质、提升耕地生产力的重要措施[19-20]，但是有关DMPP 配施生物炭对水稻产量及氮肥利用率的研究目前少有报道。我们的研究结果表明，与单施DMPP 处理相比，配施生物炭能提高2 种水稻土水稻产量和氮肥利用率，尤其在中性水稻土中，配施500 ℃生物炭不仅能显著提高水稻籽粒产量和氮肥利用率（P＜0.05），还能提高籽粒氮含量，这可能与生物炭可以提高水稻根系活力，增强氮素吸收利用能力有关[21]。本研究中，2 种生物炭的促进效果不同，在中性水稻土中配施500 ℃生物炭显著优于300 ℃生物炭，这可能是由于低温制备的生物炭含有较多的挥发性物质和有机物（如酚类）等，对水稻生长反而有一定的抑制作用[22]。

DMPP 施入土壤后会对土壤微生物的活性、种群结构和数量产生影响。通常情况下，氨氧化细菌被认为是氨氧化过程的主要参与者，所以，目前大多数研究认为DMPP 通过抑制氨氧化细菌的活性来抑制硝化反应的进行[31]。本试验中，单施DMPP后，2 种水稻土中AOBamoA基因拷贝数都有所下降，而AOAamoA基因拷贝数没有显著变化，进一步证实DMPP 主要通过抑制氨氧化细菌的活性来抑制土壤硝化作用，主要原因在于DMPP 对土壤中AOB 氨单加氧酶转录活性的抑制作用远大于AOA[32]。近年来，有关生物炭对土壤氨氧化微生物的影响也有相关报道[33]，而DMPP 配施生物炭对土壤氨氧化微生物的影响如何目前还不清楚。本研究中，DMPP配施生物炭对水稻土AOA丰度没有显著影响，而对AOB 的影响在2 种土壤中完全不同。在酸性水稻土中，配施生物炭处理提高了AOB 丰度，主要原因在于配施生物炭增加了生物炭-土壤复合体对DMPP的吸附，进而降低了DMPP对AOB的抑制作用。而在中性水稻土中，AOB丰度显著降低，尤其在水稻生长前期。这与KEIBLINGER等[12]的研究结果一致，即配施生物炭对DMPP 的硝化抑制效果有协同增强作用。生物炭配施对水稻土氨氧化细菌的影响不仅取决于土壤类型，还取决于生物炭原料种类和烧制温度[34]。在中性水稻土中，2种生物炭对AOB的协同抑制效果不同，以500 ℃生物炭更加明显（P＜0.05），推测其与生物炭的毒性有关。已有研究表明，随着裂解温度的提高，生物炭芳香族化合物增加，可能影响氨氧化微生物的活性[35]。