传统方法与分子生物检测结核病的比较研究

王茂全

摘要：目的：比较传统方法与分子生物检测结核病的有效性。方法：选择2016年～2017年在医院就诊的疑似结核患者90例。检测方法采用分子生物检测方法与传统方法，比较两种方法的有效性。结果：传统方法检出率为62.2%，生物检测方法检出率为82.2%。传统方法检出率低于分子生物检测法检出率（P < 0.05） ，差异具有统计学意义。两方法检测阳性符合率为75.6%。结论：在结核病检测中，生物检测方法比传统方法有更多的优点，例如较为方便、速度快、出错率低等，具有良好的诊断价值，适合临床医疗在诊疗活动中使用。

关键词：传统方法;分子生物检测方法;结核病;比较

结核病是由结核分枝杆菌所引起的一类传染性疾病，是由单一病原体传染而引发的死亡数最多的疾病[1～2]。在2010年，我國进行了一次结核病流行病学筛选，流调结果表明，我国每年有超过130万的结核病病人，在全世界的结核病患者中，占比约13.2%，位居全球第二[3～4]。经过过去很长时间的努力，我国结核病的发病率在一定程度上得到了控制，结核病的发病情况趋于平稳。但最近这些年[5～6]，我国部分地区结核病再次增多，使得研究人员对此现象十分重视。结核病的初步预防很关键，重点依靠实验室诊断、结核病的鉴定、诊疗的实施。当下结核病检测方法需要的时间比较长，不符合临床的实际需求，因此，必须研究一种新的方法[7]。文章选择2016年～2017年来医院就诊的90例疑似患者，对传统方法与分子生物检测法进行对比，对所获得的结果进行分析。现报道如下：

1 对象与方法

1.1 一般资料

本研究选择2016年～2017年来医院就诊的90例疑似患者，其中男性占比5/9，女性占比4/9，所有患者的年龄30～73岁，年龄的均值与标准差分别是45.4岁、3.6岁，所有选定的患者都被告知本研究的科学目的，同时签署了知情书。

1.2 方法

仪器：PCR仪器所采用的是宏石SLAN-96P。

标本采集液：在采集到的痰液标准样板中加入4%NaOH饱和溶液，加至4倍痰液体积，混匀，室温放置30 min使其液化，取1 mL置于离心管中。离心机12000 rpm，离心5min，除去上清，沉淀后加入1 mL无菌试验生理盐水，搅拌均匀，12000 rpm重复离心5 min，洗涤两次[8～9]。沉淀后加入50 μDNA提取液，充分搅拌得到饱和溶液中的水不溶性成分，采集过程中应使用进样器充分混合均匀平衡[10]。如果移液器吸头太细而无法消化吸收或堵塞吸头，使用未受污染的吸头将其从移液器吸头顶部取出并切成块，然后置于金属浴中10 min，离心5 min，12000 rpm。

检验方法：所有标本均通过提取病原载玻片、抗酸染色光学显微镜和荧光定量PCR检查采集。取一个PCR反应管，插入已解析的质量保险单，8 000 rpm离心5秒，将反应管置于PCR检测器中，增加至93℃预旋2 min，然后93℃45 s，55℃120 s，30个循环后，置于33℃条件下;PCR反应后检测荧光，将PCR管充分冷藏至33℃，扩增后的反应管迅速放入荧光中，检测仪读取并记下数据，荧光激发波长487 mm，检测波长525 mm。

1.3 统计学处理

统计分析软件采用SPSS ，计量资料用均数、标准差表示，两两比较采用独立样本t检验;计数资料用百分比表示，两两比较采用χ2检验。P < 0.05，差异具有统计学意义。

2 结果

传统方法检测阳性56例，检出率62.2%;分子生物检测方法检测阳性74例，检出率82.2%。传统方法阳性检出率低于分子生物学检测方法（P < 0.05） ，差异有统计学意义（χ2 = 8.792） 。两方法检测阳性符合率为75.6%（56/74） ，见表1

3 讨论

结核病是由结核分枝杆菌所引起的，近年来流行率再次持续上升。结核病检测是诊断结核病最特异的方法，痰涂片是肺结核患者诊疗、判断、开具治疗计划、评估治疗结果的常用方式或方法。涂片抗酸染色迅速方便，同时因为非典型分枝杆菌在中国基本上看不到，如果分枝杆菌出现阳性，那么大体上能够判断结核病。样品在体外聚合，采用链式反应（PCR） 方法，扩增出结核杆菌中所含的DNA，并通过电泳进行检测。该方法不用体外预培养，2d就可以获得报告，节省时间并且很方便，可识别细菌种类，但不足之处是可能存在假阳性或假阴性的情况。 PCR技术的应用对于临床疗效评价、传染病控制和发病机制调查具有重要意义。因为被结核杆菌所感染后并不会出现任何显著的症状，只是PPD检测结果是阳性，所以结核病的判断是临床科研以及结核病预防的关键。过去，肺结核的临床判断大多数是按照就诊病人的临床体征，再加上相应的检测化验数据，但由于很多的就诊病人并未存在明显的症状，所以临床诊断困难。实验室结核病的判断大体上是以细菌涂片与痰培养为核心。痰涂片检查法能够判断出结核病的传染源，价格便宜，适合我国国情，然而检测阳性率不高，进而使得对结核病的判断不够准确。然而在当下的结核病实验室测试中，痰培养诊断还是金标准，尤其是针对药敏检测，在患者临床用药和耐药性检测等方面有着十分关键的价值，但检测周期还是比较长，所以需要进行更新。

在治疗结核病领域，生物技术逐渐获得了广泛的应用，其中便包括PCR荧光技术的广泛应用 [11～15]。PCR技术采用结合分枝杆菌为非特异性引物、非特异性荧光探针、PCR反应液、高温DNA聚合酶、单四多肽链等成分，在体外扩增的基础上检测结核分枝杆菌。

PCR技术在生物检测法中的实施是在PCR反射中加入荧光功能基团，检测荧光数据信号的积累，检测PCR的全过程，并对样品中DNA确定的过程。测试结果在1d内获得[16～18]。PCR扩增在封闭状态下进行，会降低环境的影响，减少阳性结果的出现，在检测灵敏度上确定性很高[19]。

本研究获取90份疑似患者痰标本，采用传统方法、生物检测法分别进行检测，传统方法痰涂片阳性率为62.2%，生物检测方法阳性率为82.2%，两种方法的差异具有统计学意义（P < 0.05）。

总而言之，在结核病的检测过程中，生物检测方法比传统方法有更多的优点，例如较为方便、速度快、出错率低等，具有良好的诊断价值，适用于临床医学用途。但是，随着对结核分枝杆菌的科学研究不断增多，许多新的检测方法层出不穷，虽然每一种检测方法都有其自身的优劣势，而且部分新研究出来的检测方法还未能在临床上普及，甚至有一部分还在实验室阶段，但是相信随着我国基础医学以及生物科技的不断进步，研究探索从整体的角度进行，从细菌水平到分子水平，从传统的实验室方法到现代的实验室方法，并且在各个层次和深度上不断进化和完善，这样就可以一个接一个地走进医院，以理想化的方式成功完成结核病的检测[20～22]。作为医学检验技术人员，每个人都必须掌握新的专业知识和新技术应用，寻找一种高精度、非特异性、高灵敏度、简便快捷的结核分枝杆菌检测新方法。

参考文献

[1]Lawn SD，ZumLa AI.Tuberculosis[J].Lancet，2011，378（9785）：57-72.

[2]全国第五次结核病流行病学抽样调查技术指导组，全国第五次结核病流行病学抽样调查办公室.2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告[J].中国防痨杂志，2012，34（8）：485-508.

[3]李强，夏辉，欧喜超，等.应用线性探针技术与传统藥敏试验检测耐药结核病的成本比较[J].中国防痨杂志，2013，35（3）：187-190.

[4]赵琪林.三种检测方法对结核病诊断价值的比较研究[J].中国药物经济学，2012，16（3）：85-86.

[5]李荣辉，罗又玮.4种检测方法在诊断结核病中的价值分析[J].临床合理用药杂志，2016，9（23）：96-98.

[6]冯玉敏.结核病的实验室诊断方法学比较及进展[J].中国城乡企业卫生，2015，30（4）：29-31.

[7]王震，龚玉华，钱彩娣，等.5种结核杆菌检测方法的临床应用价值[J].检验医学与临床，2015，12（3）：334-336.

[8]张威，李国兰，徐杰，等.3种结核病快速诊断新技术与传统方法的对比分析[J].中国卫生检验杂志，2016，27（22）：3245-3247.

[9]梅早仙，韩骏锋，吴琦.结核分枝杆菌耐药性检测新进展[J].国际呼吸杂志，2015，35（8）：611-615.

[10]高孟秋，刘菲，纪滨英，等.两种γ-干扰素释放分析在结核病临床诊断中的比较研究[J].中华结核和呼吸杂志，2012，35（10）：762-765.

[11]陈雪林，崔嘉，刘宇，等.两种全血γ-干扰素释放试验试剂盒在结核病诊断中的比较研究[J].中华临床医师杂志，2013，6（24）：11380-11383.

[12]鲍磊，李涛，卢水华.全血γ干扰素释放试验在儿童和成人中的结核病诊断价值[J].微生物与感染，2014，9（1）：21-27.

[13]陆宇.结核分枝杆菌活菌检测方法及应用[J].中华结核和呼吸杂志，2004，27（6）：423-426.

[14] Dye C，Williams BG.The population dynamics and control of tuber culosis[J].Science，2010，328（5980）：856-861.

[15] 中国防痨协会临床专业委员会.结核病临床诊治进展年度报告年（第一部分，结核病临床诊断） [J].中国防痨杂志，2013，35（6）：405-424.

[16] Diya Lu，Cheng Chen，Shenglei Yu，et al.Diagnosis of tuberculous meningitis using a combination of peripheral blood T-SPOT.TB and cerebrospinal fluid Interferon-γ detection methods[J].Lab Med，2016，47（1）：6-2.

[17]葛均波，徐永健.内科学[M].第8版.北京：人民卫生出版社，2013：66.

[18] 王海英，王仕昌，赵静，等.结核感染T淋巴细胞斑点试验技术在学校结核密切接触者中筛查潜伏结核感染的应用[J]. 中华检验医学杂志，2009，32（ 9） ： 1030-1033

[19]张建武，魏存乐，吉焕英，等.结核PCR定量测定在结核病诊断中的应用[J]. 北方药学，2013，10（10）：3.

[20]卞永娟.PCR技术在结核病诊断中的价值[J].中国社区医师，2015（24）：117-117.

[21]梁斌.实时荧光PCR方法与痰涂片法检测结核杆菌的价值分析[J].中国疗养医学，2020，29（7）：3.

[22]张少静，翟振国，田清武，等.不同检测手段对结核病诊断价值的比较[J].康复与疗养杂志，1996（4）：156-158.