补肾益气和血方对大鼠卵巢储备功能的影响与作用机制

尹 燕 金志春 杨雅琴 唐 娜 李 卉

1 湖北省妇幼保健院(武汉，430070)，2 湖北中医药大学

卵巢储备功能下降(DOR)早期预防，避免卵巢功能进一步衰退临床意义重大。目前预防DOR仅限于激素替代疗法，疗效有限。中医认为本病的发生多与肾虚有关，并涉及冲任气血虚滞。前期临床观察表明，补肾活血中药具有整体调控优势，能显著改善生殖内分泌和免疫系统等功能[1]。本研究从中医“精血互生”角度出发，通过观察补肾益气和血方对DOR模型大鼠卵巢血管生成和血清性激素的影响，探讨其干预DOR的作用与机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

采用SPF级性成熟SD雌性大鼠，12周龄，健康，雌性，体重250～280g，由武汉华联科生物技术有限公司提供[许可证号SCXK(鄂)2015-0018，合格证编号42000600029456]。

1.2 实验仪器及试剂

MD1000型正置显微镜和RM2235型石蜡切片机(徕卡显微系统有限公司)；酶标仪(Labsystems Multiskan MS，芬兰)；普通PCR 仪(杭州柏恒科技有限公司)；荧光定量 PCR 仪(Bio-Rad，美国)；凝胶成像系统(北京君意东方电泳设备有限公司)。酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(武汉贝茵莱生物技术有限公司)。兔抗鼠VEGF多克隆抗体(abcam公司)；Trizol总RNA提取试剂盒购(ambion公司)。PCR引物(武汉擎科创新生物科技有限公司)。SYBR Green PCR 试剂盒(KAPA Biosystems 公司)。

1.3 实验药品

雷公藤多苷片10mg /片(湖南协力药业有限公司)；戊酸雌二醇片1mg/片(拜耳医药有限公司)；中药(补肾益气和血方：熟地 15g，菟丝子 15g，补骨脂 10g，龟板胶 15g，鹿角胶 15g ，山茱萸 15g，山药 15g，枸杞 10g，当归 10g，白芍 10g，川芎 12g，益母草10g，党参 15g黄芪 15g)免煎颗粒剂(华润三九医药股份有限公司)用纯净水配制成低、中、高 3 个浓度混悬药液，4 ℃保存备用。

1.4 动物造模[2-3]

将有正常动情周期的大鼠给予雷公藤多甙50mg/(kg·d)灌胃，连续21d，每周称体重调节给药量；于灌胃第4 天起，每日上午9 点阴道细胞学涂片，观察动情周期变化情况，全部大鼠出现动情周期紊乱，可确定造模成功。

1.5 动物分组及给药

将48只大鼠随机分为空白组、模型组、西药组与中药低、中、高剂量组，每组8只。空白组每天上午9时，下午16时分别2次给予生理盐水15 ml/kg，连续21d。其余5组每天上午9 时给予雷公藤多苷50 mg /kg灌胃，下午 16 时分别给予对应剂量药物灌胃。模型组给予生理盐水15 ml/kg；西药组给予戊酸雌二醇0.2mg /kg药液；中药给予补肾益气和血方免煎颗粒剂，给药剂量根据“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”[4]计算，低、中、高剂量组分别按临床等效剂量的 0.5 倍(4.31g/kg)、1 倍(8.62g/kg)和 2 倍 (17.25g/kg)给药。给药体积均为 12ml/kg,连续 21 d。

1.6 取材与指标检测

①给药21d后连续阴道涂片5d。方法:用小棉签蘸生理盐水少许，轻轻插入大鼠阴道内旋转后取出、涂片、置于95%乙醇固定后HE 染色，显微镜下观察阴道上皮脱落细胞及动情周期变化情况。②于大鼠间情期腹主动脉取血，常温下静置30 min，3000 r /min 离心分离血清，-20℃保存。ELLSA法测定促卵泡生成素(FSH)、黄体生成素(LH)、雌二醇(E2)、抗苗勒氏管激素(AMH)水平。③剖腹取双侧卵巢称重，计算各组卵巢、子宫指数(组织重量/体重×100%)，福尔马林固定，24 h内梯度乙醇脱水，石蜡包埋，连续作5μm切片，HE染色，显微镜观察大鼠卵巢组织形态学变化(各级卵泡、黄体、闭锁细胞、颗粒细胞、间质等)。④采用免疫组织化学法测定卵巢血管内皮生长因子(VEGF)及其受体蛋白。Lecia Applaction Stiue 图象系统采集分析样本，细胞胞质出现淡黄色或黄色颗粒状着色为阳性表达，采用IPP6.0软件检测切片中VEGF及其受体flt-1、kdr蛋白的积分吸光(IA)值。⑤RT-PCR 法检测卵巢中VEGFmRNA 的表达。Trizol法提取总RNA，逆转录为cDNA，PCR扩增，反应体系为上游引物F 5mol，下游引物R 5mol，每孔加入对应的cDNA 1μl，加dd H2O 补足至20 μl，按照如下程序进行：95℃ ，3min；95℃，5 sec；56℃，10 sec；72℃，25 sec；39 cycles；65℃，5 Sec；95℃，50 Sec。以β-Actin基因为内参，与目的产物比较进行相对定量，结果用2-ΔΔct法表示，各个引物序列见表1。

表1 引物序列

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 一般情况、动情周期、卵巢和子宫指数

给药结束后，模型组、西药组较空白组大鼠毛色黯淡、形体消瘦，个别大鼠表现出精神萎靡不振，反应迟钝；中药低剂量组饮食量略减少，中、高剂量组大鼠上述症状不明显。给药前各组大鼠动情周期无变化，均为4～5d。给药后空白组动情周期正常；模型组动情周期明显延长至7～9d，连续5d涂片仅见中层细胞混杂较小的表层细胞，核深染；中药低、中剂量组动情周期稍延长至6～7d；西药组、中药高剂量组动情周期为5～6d。模型制备21d后，与空白组比较，各组卵巢指数均有不同程度的下降，其中模型组、中药低剂量组卵巢指数明显降低(P<0.01)；与模型组比较，中药高剂量组卵巢指数升高(P<0.01)。与空白组比较，模型组、中药低剂量组子宫指数明显降低(P<0.01)；与模型组比较，中药中、高剂量组子宫指数均增高(P<0.01)。见表2。

表2 各组大鼠卵巢和子宫指数比较

2.2 卵巢组织形态学变化

见图1(423页)。空白组: 卵巢皮、髓质结构清晰，可见各级卵泡(原始卵泡、 初级卵泡、次级卵泡、成熟卵泡和黄体)，卵泡形态、数量正常; 颗粒细胞(GC) 层次多，卵泡液含量多; 黄体数目较多，且胞浆丰富，色泽鲜艳；间质未见炎细胞浸润及纤维化，血管丰富。模型组: 卵巢萎缩，各级卵泡数均明显减少，趋于闭锁卵泡较多; GC层数少; 部分黄体坏死，间质大多有不同程度的炎细胞浸润，未见纤维化。西药组：各级卵泡减少，但仍有发育良好的卵泡，闭锁卵泡增多。中药低剂量组:各级卵泡减少，GC层次少但较模型组多，卵泡液含量少; 黄体数目减少，见少量闭锁卵泡。中药中、高剂量组组织形态与空白组基本相似。

2.3 血清性激素水平

见表3。与空白组比较，模型组、西药组、中药低、中、高剂量组FSH水平增高，模型组、西药组FSH/LH比值升高，模型组、西药组、中药低、中、高剂量组E2、AMH水平均下降(均P<0.01)；与模型组比较，中药中、高剂量组FSH水平下降，中药高剂量组FSH/LH比值下降，西药组、中药中、高剂量组血清E2、AMH水平均升高(均P<0.01)；与西药组比较，中药中、高剂量组FSH水平下降，中药低、中剂量组E2水平均下降(均P<0.01)。

表3 各组大鼠血清FSH、E2、AMH水平及FSH/LH的比较

2.4 卵巢组织VEGF及其受体蛋白

见表4。干预21d后，与空白组比较，模型组VEGF及其受体flt-1、kdr蛋白量降低(P<0.05)；与模型组比较，中药低、中、高剂量组VEGF及其受体flt-1、kdr蛋白量均增高(P<0.01)。

表4 各组卵巢组织VEGF及其受体flt-1、kdr蛋白IA值比较

2.5 卵巢VEGFmRNA表达情况

见表5。干预21d后，与空白组比较，各组大鼠卵巢VEGFmRNA表达均降低(P<0.01)；与模型组比较，各组大鼠VEGF mRNA表达均升高(P<0.01)。

表5 各组大鼠卵巢VEGFmRNA表达比较

3 讨论

中医学无DOR病名，可见于“经水早断”“月经过少”“闭经”“血枯”“月经后期”“不孕”等疾病范畴。中医理论认为，肾精肾气充足、冲任气血通盛，维持女性生殖功能的根本；肾精肾气不足、冲任气血虚衰，则生殖功能减退[5]。因此，肾精是生殖功能之本，是卵巢储备功能之根，肾精亏虚则卵巢储备功能不足，生殖功能减退；以补肾为中心，运用补肾填精中药(菟丝子、补骨脂、龟板胶、鹿角胶、熟地等)可以补充肾精，肾精充盛，化生天癸，充养冲任，使冲任气血通盛；脾为后天之本，后天水谷化生气血，气血可以充养肾精，精血互生，若肾虚日久, 肾气不足，不能化生天癸以充养冲任，则冲任会出现虚滞，在补肾之时，辅以健脾益气(黄芪、党参、山萸肉、山药等)和养血活血中药(当归、川芎、益母草等)，对先天肾精的耗损会起到一定的减缓作用。

本课题组前期研究显示，补肾活血方具有一定的防治卵巢早衰作用[6]。本实验在此基础上，依据“肾藏精，脾生气血，精血互生”中医理论，采用DOR模型大鼠进行实验，试图探索“补肾益气和血法”中药与卵巢周期性激素分泌、卵巢组织血管生成之间的相关性，从动物实验角度为中药防治DOR寻求依据。

FSH、LH 水平是反映卵巢储备功能力的间接指标，早期FSH/LH比值升高, 预示卵巢储备降低, 可能较FSH、E2更为敏感[7]。随着卵巢中卵泡耗竭，颗粒细胞减少，E2水平下降，对垂体反馈抑制作用减弱，出现高FSH血症，是预测卵巢储备能力的直接指标[8]。AMH随年龄增加而下降，AMH缺乏可加速原始卵泡的募集及耗竭，是预测卵巢储备功能的标志物[9]。本研究使用雷公藤多苷片造模后，模型组大鼠动情周期明显延长，卵巢、子宫指数均明显下降，血清 FSH、FSH/LH 水平明显升高，AMH、E2水平显著降低，说明造模成功。研究结果表明，与模型组比较，补肾益气和血方高剂量组能显著改善降低的卵巢、子宫指数；中药中、高剂量组能显著降调FSH水平和FSH/LH比值，提高E2、AMH水平，与西药组比较，中药中、高剂量组FSH水平降低，中药低、中剂量组E2水平降低，而中药高剂量组E2水平与西药组无统计学差异。提示补肾益气和血方可能降低血清FSH和FSH/LH比值,提高E2、AMH水平。

卵巢内血管结构和微循环血流是维持卵泡生长、类固醇激素分泌及卵泡对促性腺激素敏感性的重要因素[10]， VEGF是主要的血管生成调节因子之一，通过与细胞膜上的受体结合刺激内皮细胞有丝分裂从而促进血管生成，增加血管通透性[11]。目前己发现的VEGF 受体有4 种，其中flt-1、Flk-1/kdr是研究最多的受体。在某些病理情况下，flt-1的作用是诱导VEGF 与kdr 结合，从而发挥VEGF 促血管形成的生物学作用[12]。kdr与配体VEGF结合后介导内皮细胞的增殖、分化以及血管形成过程和血管通透性，是血管发生和构建的主要调节者[13]。本实验结果显示，与空白组比较，模型组VEGF及其受体flt-1、kdr蛋白表达量显著降低；与模型组比较，不同浓度的中药干预后，flt-1、kdr蛋白和其相应的mRNA表达量均显著增高，但与西药组比较无差异，提示补肾益气和血方可能有一定的促进卵巢组织血管生成作用，其机制可能是通过上调VEGF/ VEGFR蛋白及其相应的mRNA表达，从而改善卵巢组织血液循环，保护卵巢储备功能。