术前外周血单个核细胞微RNA-192对孤立性肝细胞癌微血管侵犯的预测价值

丁雪梅，武世伦，孙文兵

1 首都医科大学附属北京世纪坛医院 健康体检中心，北京 100038;2 首都医科大学附属北京朝阳医院西区 肝胆胰脾外科，北京 100043

目前，肝细胞癌(以下简称肝癌)病死率位居肿瘤相关性死亡第2位，仅次于肺癌[1]。肝癌的治疗首选方式仍以手术治疗为主，但由于肝癌易复发以及转移，患者预后情况仍然较差[2]。研究[3]认为，微血管侵犯(microvascular invasion，MVI)是肝癌患者术后复发以及影响患者术后生存率的一个独立危险因素。目前，对于MVI的诊断主要依靠术后病理检查，因此寻求术前无创、有效的MVI预测工具，对于患者手术方式以及术后治疗方案的选择具有重要价值。外周血单个核细胞微RNA(miRNA，miR)的检测作为近年来关注的焦点，成为临床诊断和预后预测的无创检测方法之一。miRNA属于非蛋白质编码的小分子RNA，miR-192基因位于11号染色体，在肝脏、结肠、肾脏等组织中表达。研究[4]显示，miR-192与多种肿瘤的发生发展及患者预后密切相关。另有研究[5]发现，miR-192在肿瘤进展以及血管侵袭方面具有重要的调控作用。为了进一步提高对肝癌患者术后MVI预测准确性，本研究探讨分析术前外周血单个核细胞miR-192对孤立性肝癌血管侵犯的预测价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2018年3月—2020年4月在北京朝阳医院西区肝胆胰脾外科接受治疗的肝癌患者136例，其中男78例、女58例，年龄34～79岁，平均(53.82±11.98)岁。根据术后病理检查有无MVI分为MVI组(n=41)和非MVI组(n=95)。

1.2 纳入标准及排除标准 纳入标准：(1)术前B超、CT和/或MRI检查诊断为肝癌，且无肝外转移灶，并经术后病理证实；(2)均为首次行根治性切除术治疗，术前未接受任何放疗、化疗以及其他治疗方式；(3)术中切缘距肿瘤边缘至少1 cm以上，且切缘阴性；(4)患者术前影像学检查未见大血管侵犯；(5)临床资料及影像学资料完整。排除标准：(1)全身状况差，肝功能Child-Pugh C级；(2)术前合并全身感染；(3)合并其他原发性恶性肿瘤。

1.3 术前外周血单个核细胞miR-192检测 术前抽取患者外周血4 ml，使用EDTA-K2抗凝，使用淋巴细胞分离液分离出外周血单个核细胞(PBMC)，使用PBS冲洗2次，将700 μl Qizol加入PBMC中混匀备用。使用Trizol试剂提取PBMC中总RNA，然后使用逆转录试剂盒将其转录为cDNA，然后按照SYBR Green EXScript TMPCR Kit操作程序进行PCR扩增，使用U6作为内参基因。miR-192以及U6引物序列由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表1。PCR反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s、60 ℃退火延伸20 s，共完成40个循环。使用2-△△Ct计算miR-192相对表达量。

1.4 术前超声检查 采用LOGIQ E9型彩色多普勒超声诊断仪，超声探头频率3.5～5.5 MHz，检查时取仰卧位，对患者肝脏、脾脏等脏器各切面进行常规扫查，测量肿瘤的直径，并记录肿瘤结节类型以及包膜情况。结节包括3种类型：类圆型、单结节型以及多结节型；包膜分为3种：包膜完整、包膜缺损以及无包膜。由2位高年资医师单独阅片后给出诊断结果，若结果不一致，则由上述2位医师商讨复核后达成一致。

1.5 MVI判断方法 参照《原发性肝癌规范化病理诊断指南(2015年版)》[6]明确术中病理取材部位以及数量，对标本进行固定硬化后切成薄片，将其制成病理切片并进行HE染色封片，在显微镜下观察是否有MVI，即微小静脉(包括门静脉分支、中央静脉或包膜外小静脉)内漂浮成团癌细胞，并且周边有明确的血管内皮细胞环绕。

1.6 伦理学审查 本研究由经北京朝阳医院伦理委员会批准同意，批号：2018HL006。患者均签署知情同意书。

2 结果

2.1 MVI组与非MVI组患者外周血单个核细胞miR-192水平比较 MVI组患者术前外周血单个核细胞miR-192相对表达量明显低于非MVI组，差异有统计学意义(0.798±0.164 vs 1.086±0.215，t=7.663，P<0.001)。

2.2 影响MVI发生的单因素分析 对可能影响MVI发生的各因素进行单因素分析，结果显示：肿瘤直径、结节类型、包膜类型与MVI发生有关(t=3.828、χ2=5.422、χ2=5.914，P值均<0.05)(表2)。

表2 MVI发生单因素分析

2.3 影响MVI发生的多因素分析 将单因素分析有统计学意义的因素纳入多因素logistic回归分析，结果显示：术前miR-192(OR=3.999，95%CI: 1.585～10.086，P=0.003)、结节类型(OR=3.241，95%CI: 1.154～9.106，P=0.026)以及包膜类型(OR=2.776，95%CI: 1.088～7.084，P=0.033)是影响肝癌患者MVI发生的独立危险因素，即术前miR-192偏低、多结节以及无包膜将增加MVI的发生风险(表3)。

表3 多因素logistic回归分析

2.4 外周血单个核细胞miR-192对MVI预测价值 采用ROC曲线分析患者术前外周血单个核细胞miR-192对MVI预测价值，结果显示：曲线下面积为0.872，敏感度为68.38%，特异度为70.59%，95%CI: 0.768～0.931，最佳截断值为0.858(图1)。

图1 术前外周血单个核细胞miR-192预测MVI的ROC曲线结果

3 讨论

随着现代分子生物学的发展和进步，研究者们对肝癌的认识不断深入，以往仅关注于肿瘤数目、大小以及肝外转移、肉眼可见癌栓等，而现在，越来越多的学者关注于MVI，并进入了微观肿瘤世界的研究[7]。研究[8]认为，MVI是影响肝癌早期复发的重要因素之一，而长期以来，临床一直忽略MVI的诊断，且并未将其列入肝癌病理诊断常规指标，也没有统一的诊断标准。《原发性肝癌规范化病理诊断指南(2015年版)》[6]首次提出MVI诊断标准及其取材要求，同时也明确MVI是一个病理学概念。MVI以癌旁肝静脉或门静脉细小分支为主，可侵犯胆管、肝动脉以及淋巴管分支，目前文献[9-10]报道肝癌患者MVI发生率在21%～63%。研究[11-12]认为，MVI是癌细胞逐步破坏周围组织的一个过程，具体可将其分为3个步骤：(1)癌细胞克隆性增生；(2)癌细胞侵犯周围基质、侵入微血管、破坏内皮细胞、形成微癌栓；(3)癌栓进一步增大、脱落和转移。微血管是肝癌发生转移的一个重要通道，MVI预示着肿瘤的转移，因此微血管被认为是肿瘤转移第一站。

miR-192基因多在肝脏、结肠以及肾脏等组织器官中表达，研究[13-14]显示，miR-192在多种肿瘤组织中表达水平显著降低，被称为肿瘤异质性miRNA。miR-192在肿瘤组织以及正常组织中的差异性表达可用于恶性肿瘤的早期诊断，同时miR-192在肿瘤转移、分期以及患者预后判定等过程中均有重要意义[15-16]。本研究着眼于分析术前外周血单个核细胞miR-192对孤立性肝癌MVI的预测价值。

本研究结果显示，MVI组患者术前外周血单个核细胞miR-192相对表达量显著低于非MVI组。与既往报道[17-18]结果相似。miR-192作为一种抑癌基因，其表达与恶性肿瘤患者肿瘤转移的发生有关，同时miR-192可能是肝癌MVI发生的调控基因之一。单因素及多因素logistic回归分析结果显示，术前超声影像特征(包括结节类型和包膜类型)以及miR-192水平均为MVI的独立危险因素，提示术前miR-192水平与MVI之间具有密切的联系。此外，采用ROC曲线进一步分析术前外周血miR-192相对表达量对MVI的预测价值，结果显示，曲线下面积为0.872，提示术前外周血单个核细胞miR-192水平检测对肝癌患者MVI具有较高的预测价值。对于术前预测MVI发生风险高的患者，提示其术后复发的风险较高，可以给予针对性的靶向、免疫、介入治疗等，密切监测患者miR-192变化，从而降低复发风险，改善患者临床预后。

随着现代生物医学技术的不断发展，外周血单个核细胞miRNA检测受到了越来越多研究者的关注，作为一种无创的检测方式，可为疾病的诊断和预后预测提供更多的支持[19-20]。但是由于本研究纳入样本量较小，且并未针对分析不同指标之间联合应用是否能够提高诊断效能，因此下一步研究还需要扩大样本量，并对其可能的机制及最佳的诊断预测方案进行分析。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：丁雪梅负责课题设计，资料分析，撰写论文；武世伦负责收集数据，修改论文；孙文兵负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。