OX40 对2 型糖尿病患者外周血黏膜相关恒定T 细胞的调亡作用及意义

张梅，陆文敏，钟国权，徐令清，吴永坚

（1.广州医科大学附属第六医院清远市人民医院，广东 清远 511518；2.广州医科大学广州妇幼医疗中心，广东 广州 510120）

0 引言

糖尿病患者持续性的高血糖会导致自身免疫细胞含量的改变甚至变异，以往实验已证实，由多种免疫和炎症性疾病导致免疫稳态失衡的重要因素是T 细胞功能失常[1,2]，其可能是T 细胞过度活化释放了大量炎性细胞因子并诱导炎性反应以及引起自身免疫应答，同时还释放相应的细胞因子并参与糖尿病进展[3-4]。然而，黏膜相关恒定T 细胞（mucosal associated invariant T cells，MAIT 细胞）的作用和机制依然不清楚。本研究拟探讨2 型糖尿病病人（T2DM）MAIT 细胞上OX40 的表达水平及OX40 促进活化诱导T2DM 中MAIT 细胞凋亡作用[5,6]，进一步讨论OX40 对MAIT 细胞的免疫调控在2 型糖尿病发病中的作用，为靶向OX40+MAIT 细胞可能是治疗T2D的一种有前途的方法提供新的数据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集2019 年8 月于广州医科大学附属第六医院清远市人民医院治疗的51 例2 型糖尿病患者作为2型糖尿病组（T2DM），其中男27 例，女24 例，年龄22～82 岁，年龄（55.6±9.2）岁；所有T2D 患者临床表现为高血糖，诊断及分型依据按照2010年WHO 标准执行。另取性别和年龄相匹配的标准化OGTT 试验结果无异常的健康成年志愿者44 名为健康对照（HC）组，其中男19 例，女25 例，年龄24～76 岁，年龄（54.2±10.3）岁。

1.2 试剂与仪器

细胞固定液、渗透缓冲液和破膜剂均购自美国eBioscience 公司，单克隆抗体购自美国BD 生物科学、Biolegend 公司。流式细胞分析采用美国BD 公司LSRFortessa 型流式细胞仪。

1.3 检测方法

流 式 细 胞 术 检 测OX40、CD3、TCRVa7.2+、CD45RO、CD8、CD69 和Fas 指标的表达。采用BD 磁珠分离系统分离出TCRVa7.2+细胞亚群（MAIT 细胞）；检测外周血分离的MAIT 细胞中caspase-3 的表达。

1.4 数据分析

采用SPSS 24.0 软件对数据进行统计分析，符合正态分布的计量资料数据用（）表示，组间率的比较采用卡方检验，P<0.05 有统计学差异。

2 结果

2.1 T2D 病人外周血MAIT 细胞数量减少

流式检测外周MAIT 细胞的比例，结果见表1,T2D组的MAIT 细胞比例明显低于HC 组。进一步采用流式分析OX40 在MAIT 细胞的比例，结果为T2D 组的MAIT 表面OX40 比例明显高于HC 组，表达增加，结果见表1。

表1 OX40 及MAIT 细胞的比例

2.2 CD45RO、CD69 和Fas 在OX40+组中增加

进一步分析OX40 阴性和阳性两个亚群在MAIT细胞中以下指标的表达，发现OX40-的MAIT 细胞表面效应分子CD45RO 的比例显著低于OX40+组；在OX40-细胞中的活化分子CD69 和死亡受体Fas 的平均荧光强度显著低于OX40+组，差异有统计学意义，结果见表2。

表2 OX40 在MAIT 细胞上表达与活化

2.3 HC 组OX40 和MAIT 细胞数量有显著相关性

采用SPSS 24.0 软件分析OX40 表达与MAIT 细胞数量的相关性发现，HC 组OX40 和MAIT 细胞数量有显著相关性(r=-0.53),T2D 患者的呈强负相关（r=-0.61）,差异都有统计学意义，结果见图1。

图1 OX40 表达与MAIT 细胞频率相关性分析

2.4 MAIT 细胞在T2D 疾病中凋亡比例增高

T2D 患者的MAIT 细胞分裂的caspase-3+比例明显高于正常对照组(n=20；与健康对照组(n=20；6.82±0.606%；P<0.001；图2A)，提示MAIT 细胞在T2D 疾病中凋亡比例较高。与OX40-(13.6±0.771)相比，OX40+MAIT 细胞分裂caspase-3+(22.8±1.41%)明显增加；P<0.001；图2B)，说明OX40 参与了T2D 患者MAIT 细胞的凋亡，与其MAIT 细胞循环频率降低密切相关。

图2 MAIT 细胞中裂解 caspase-3 的表达图

3 讨论

MAIT 细胞产生于胸腺，是一类进化保守的固有样T 淋巴细胞,并在胸腺重排其相对固定的链序列，其表型7.2+CDl61+，CD161 表达有利于MAIT 细胞趋向外周黏膜组织[7]。T2D 患者外周血中存在着多种不同于健康人群的淋巴细胞亚群，而其不同的亚群含量变化可以反映患者相应的免疫功能状态变化，通过分析其含量可以在一定程度上了解患者的免疫状况[8]。在本研究中，T2D 组的MAIT 细胞比例低于HC组，MAIT 细胞可能对T2D 有保护作用。OX40 在T 细胞上具有广泛的表达以及调控功能，是TNFR 超家族成员之一，其共刺激信号作用巨大，是T 细胞活化和增殖所不可缺的第二信号[9]。本研究发现，在T2D患者的MAIT 细胞上OX40 的表达明显高于健康对照组，血糖升高后可能通过促进机体的正性共刺激分子从而影响T 细胞的免疫应答[10]。本研究首次证实在MAIT 细胞上表达，参与T2D 的免疫调控作用,OX40在人MAIT 细胞中广泛表达，尤其在T2D 患者中显著。有趣的是，OX40 的表达与MAIT 细胞的产生成反比。我们推测OX40 可能在T2D 患者MAIT 细胞含量的改变中发挥着重要作用。在T2D 患者中观察到MAIT 细胞频率下降，OX40+细胞数量的增加可能与2 型糖尿病的慢性炎症程度有关[11]。

研究发现，在T2D 患者MAIT 细胞上CD45RO OX40+记忆表型含量明显高于CD45RO OX40-；表面分子CD69 OX40+表型含量明显高于CD69OX40-、FasOX40+表型明显含量高于FasOX40-，在两组人群中的差异明显[12]。CD45RO+T 细胞是具有自我更新能力的记忆T 细胞，可以维持机体免疫记忆功能以及参与再次免疫应答，不但是多能细胞，而且是T细胞的重要亚型，在许多疾病(包括糖尿病)的发生发展过程中可能起着重要的作用。现有的研究认为，CD45RO+T 细胞当其再次接触相同的抗原后会快速活化以及增殖，并释放Thl 类如IL.2、IL.4 等细胞因子，加助B 淋巴细胞合成和分泌IgG 抗体来增强机体的免疫功能[13-14]。实验中T2D 患者的CD45RO OX40+T 细胞比例明显增高，提示其在糖尿病的免疫中起着重要作用，其细胞比例高低与糖尿病病情进展有着较密切的关系。此外，与OX40-MAIT 细胞相比OX40+MAIT 细胞群体中存在高度显著的死亡受体Fas。CD69 和Fas 在OX40+MAIT 细胞中的平均荧光强度(MFI)明显高于OX40-MAIT 细胞，实验表明OX40+MAIT 细胞可能是T2D 患者激活T 细胞的一个子集，当其被激活可以表达大量的死亡受体Fas。我们发现，在T2D 组OX40+MAIT 细胞表达的表面Fas 受体和细胞内裂解的caspase-3 水平高于OX40-亚群[15-16]。OX40 与OX40L 重组蛋白激活可诱导MAIT 细胞凋亡，提示OX40 诱导的细胞死亡可降低T2D 患者外周血中MAIT 细胞的频率。我们发现OX40 在T2D 患者的MAIT 细胞中上调，并通过caspase-3 促进细胞凋亡。本研究发现MAIT 细胞的比例与其上OX40 的表达呈负相关，因此推测OX40 能通过调控MAIT 细胞在抗糖尿病中发挥重要作用。

综上所述，本研究发现T2D 患者中MAIT 细胞比例下降，其表面的OX40 分子表达明显上调，其比例与OX40 的表达呈反比，OX40 通过caspase-3 促进MAIT 细胞凋亡，这些发现拓宽了我们对OX40 的认识，我们的研究结果为T2D 期MAIT 细胞的活化和调控提供了新的思路，为靶向OX40+MAIT 细胞可能是治疗T2D 的一种有前途的免疫方法提供了新的数据。