探究MC1R基因在江西地方鸡中的变异、单倍型及其对羽色的影响

席苏望，周明芳，成 笛，陈开丰，万 磊，熊 婷，刘秋红，陈 彪，刘三凤，毛辉荣*

（1.江西农业大学动物科学技术学院，江西南昌 330045；2.江西省赣州市畜牧研究所，江西赣州 360702；3.江西省崇义县农业农村局，江西崇义 341300）

【研究意义】鸡的羽色虽不是与优质直接相关的重要经济性状，但羽色作为一个品种的独特外观，会直接影响消费者对活禽的挑选，因此一直是国内优质鸡选育的重要性状之一，备受遗传和育种学家所关注。开展基于中国地方鸡羽色性状的遗传解析将极大丰富家鸡羽色形成的分子机理，同时为地方鸡的外观选育提供有效的分子标记奠定基础。【前人研究进展】鸟类羽色根据其形成模式主要分为两类:一类是基于体内黑色素模式的称为色素色；另一类是基于外源类胡萝卜素的摄入并在体内沉积，与羽毛的微结构有关，被称作结构色，后者一般利用物理结构通过对光线的折射和干涉作用而产生变幻的色彩，可以令鸟类羽毛具有金属光泽。目前所有已鉴别的影响羽色表型的基因均是基于黑色素模式的着色，同时这类羽色表型受遗传因素的影响较大，具有显著的可遗传性[1]。鸡的羽色变异非常丰富，但目前已发现的羽色功能基因却很有限。根据最新OMIA（online mendelian inheritance in animals）在线数据库（https:∕∕omia.org∕home∕）显示，已有11个鸡羽色因果功能基因位点被鉴别，其中影响黑羽的黑素皮质激素受体1基因（Melanocortin 1 Receptors，MC1R）备受关注。

MC1R基因决定羽色扩展基因座E（Extension，E），E位点包含8个等位基因，各等位基因对应不同的羽色，黑色素沉着按照显隐性关系排列次序为:E＞ER＞EWH＞E+＞Eb＞Es＞Ebc＞Ey。鸡的MC1R基因位于11号染色体上，无内含子，主要编码G蛋白偶联受体。研究发现其蛋白表达于黑素细胞，主要负责调控黑色素生成的质量与数量，促进真黑素形成[2-3]。此外，MC1R基因是控制真黑素和褐黑素形成的开关，通过调控酪氨酸酶的活性影响真黑素和褐黑素的生产和分布，进而影响禽类羽色形成[4-6]。2003年，Kerje等[5]利用红色原鸡和白来航鸡杂交资源群体研究发现MC1R基因是控制鸡羽色的重要编码基因（E基因座），并推测MC1R基因E92K突变最可能是导致鸡黑羽的因果突变。Kabir等[7]进行了38种鸡种MC1R基因单倍型与羽色的关联性研究，发现鸡羽色的形成与MC1R基因多态性密切相关。Ling等[6]对不同羽色鸡种的MC1R基因序列比较结果表明，MC1R基因的E92K突变与鸡的黑羽有关，同时发现c.637T＞C位点可能导致cAMP信号不响应α-MSH而使个体不呈现黑羽表型。2014年，Dávila等[8]在对13个西班牙鸡种MC1R基因检测后发现c.274G＞A突变导致MC1R受体激活，进而促进真黑素生产并最终形成黑羽；同时发现c.637C＞T突变可能是导致真黑素生产功能丧失或下降的因果突变。Guo等[9]发现MC1R基因c.274G＞A促进真黑素沉积，c.637T＞C导致无cAMP信号响应α-MSH，从而减少真黑素沉积；Zhang等[10]发现c.212T＞C和c.274G＞A和c.644A＞C 3位点同时存在于中国地方黑鸡群体的每个个体，该研究小组于2020年再次认定上述3个位点作为中国地方鸡黑羽的遗传标记[11]。2020年，Kabir等[7]研究30种日本地方鸡种MC1R基因单倍型与羽色的关联性，结果表明c.427A＞G和c.274G＞A突变分别有助于黄褐色羽和黑羽的形成；推测c.644A＞C突变可能通过抑制c.274G＞A的作用下使其纯合位点导致鸡羽色呈现似小麦色。

江西地处中国的中部地区，自然资源丰富，地方鸡种资源尤为突出，目前已通过畜禽遗传资源鉴定并收录于《中国畜禽遗传资源志:家禽志》的品种主要有9个，分别是东乡绿壳蛋鸡、余干乌骨鸡、南城五黑鸡、安义瓦灰鸡、崇仁麻鸡、泰和丝羽乌骨鸡、广丰白耳黄鸡、康乐黄鸡和宁都黄鸡[12]，此外，修水黄羽乌鸡作为新发现的待鉴定遗传资源也已收录于《江西畜禽遗传资源志》[13]。江西地方鸡种不仅数量多，且种质特性独特，在羽色表型方面尤为丰富，包括5个类型:黑羽鸡（东乡绿壳蛋鸡、余干乌骨鸡和南城五黑鸡）、灰羽鸡（安义瓦灰鸡）、麻羽鸡（崇仁麻鸡），白羽鸡（泰和丝羽乌骨鸡）及黄羽鸡（广丰白耳黄鸡、康乐黄鸡、宁都黄鸡和修水黄羽乌鸡）[13]。

【本研究切入点】地方特优质肉禽的羽色直接影响消费者在活禽市场的挑选，进而影响优质禽的销售，因此家禽羽色不仅是一种品种的重要外观特征，同时还具有重要的经济效应。江西拥有多达10个地方鸡种群体，且羽色类型丰富，但到目前为止，关于江西地方鸡种羽色遗传机制的全面和系统的研究鲜见报道，基于此，本研究以10个江西地方鸡种（东乡绿壳蛋鸡、余干乌骨鸡、南城五黑鸡、安义瓦灰鸡、崇仁麻鸡、泰和丝羽乌骨鸡、广丰白耳黄鸡、康乐黄鸡、宁都黄鸡和修水黄羽乌鸡）为研究对象，采用PCR产物直接测序法和单倍型法探究MC1R基因在江西地方鸡种中的变异类型、单倍型分布及其对羽色的影响。【拟解决的关键问题】本试验旨在鉴别MC1R基因在江西10个地方鸡群体中的变异、单倍型分布及其频率分布；进一步探究MC1R基因各变异和单倍型对江西地方鸡羽色表型形成的影响，尤其是黑羽表型的形成。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验以10个江西地方鸡种群体为研究对象，涉及的实验鸡品种、样本数和羽色表型详见表1。所有实验动物样本均来自原种场的核心群体。采集每只受试鸡个体的翅静脉血1 mL并用2%EDTA抗凝剂处理，存放于-20 ℃冰箱备用。

表1 实验动物的品种、采样数及羽色表型Tab.1 Breeds，sample number and feather color phenotype of experimental animals

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取与质量检测 采用常规酚仿法[14]提取鸡血液基因组DNA，使DNA溶于TE缓冲液，使用Nano Drop 2000微量紫外分光光度计（赛默飞，美国）检测基因组DNA浓度和纯度，并采用琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性。然后将质量合格的基因组DNA稀释至20 ng∕µL的工作液，保存于-20 ℃冰箱备用。

1.2.2 引物设计与合成 根据NCBI收录的红原鸡MC1R基因序列（GeneBank登录号为AB201629），通过Primer Premier 5.0软件设计引物，引物序列为MF 5′-GCTTTGTAGGTGCTGCAGTT-3′和MR 5′-TC‐CACCCATCTGTTTGTCCA-3′，扩增片段长度为1 105 bp，引物于北京擎科生物科技有限公司湖南分公司合成。

1.2.3 PCR扩增与测序 PCR扩增反应体系总体积为25µL，分别包含1.1×T3 Super PCR Mix 12.5µL，MF 1µL，MR 1µL，DNA模板2µL，和ddH2O 8.5µL。PCR反应程序为94 ℃预变性5 min；随后进行34个循环，1次循环为94 ℃变性50 s，59 ℃退火45 s和72 ℃延伸1min；72 ℃延伸13 min；4 ℃保存。PCR产物利用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，均获得特异性目标条带，部分凝胶成像图片见图1，PCR产物的纯化和双向测序均由北京擎科生物科技有限公司湖南分公司完成。

1.2.4 序列比对和变异位点鉴别 测序结果利用SeqMan（DNASTAR 7.1）软件进行DNA序列比对和分析，检测MC1R基因的变异位点并对各个样本进行基因型判定。

1.2.5 单倍型分析 基于各个实验鸡个体的基因型数据采用PHASE v2.1软件[15]推断获得实验鸡群体的单倍型。

1.2.6 数据处理 利用EXCEL 2019软件统计MC1R基因各变异位点在试验品种群体中的基因型频率、单倍型频率，并根据基因型和单倍型在不同羽色地方鸡群体中分布情况，分析其与羽色表型的相关性。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增与测序

鸡MC1R基因扩增产物电泳图见图1。

2.2 MC1R基因的突变位点及其在江西地方鸡种中的分布频率

利用SeqMan软件对测序序列进行比对，共检测到15个突变位点（表2），其中错义突变10个，分别为c.212T＞C（p.71Met＞Thr）、c.274G＞A（p.92Glu＞Lys）、c.334C＞T（p.112Arg＞Cys）、c.366C＞G（p.122Ile＞Met）、c.376G＞A（p.126Val＞Ile）、c.398T＞C（p.133Leu＞Pro）、c.409G＞A（p.137Ala＞Thr）、c.427A＞G（p.143Thr＞Ala）、c.637T＞C（p.213Cys＞Arg）和c.644A＞C（p.215His＞Pro），同义突变4个，分别为c.69C＞T、c.486C＞T、c.552C＞T、c.636G＞A和1个缺失突变（c.547_549delAAC（p.183delAsn））；其中c.366C＞G和c.547_549delAAC系新发现的突变位点。由表2可发现，新鉴别的c.366C＞G只在白羽群体中出现，3-bp缺失突变（c.547_549delAAC）仅在极少数黄羽个体中出现。

图1 MC1R基因PCR扩增电泳图Fig.1 Gel electrophoresis of PCR amplification products of MC1R gene

位点c.212T＞C（p.71Met＞Thr）和c.274G＞A（p.92Glu＞Lys）是黑羽群体（东乡绿壳蛋鸡、余干乌骨鸡和南城五黑鸡）、灰羽群体（安义瓦灰鸡）和麻羽群体（崇仁麻鸡）中的共有错义突变类型，同时3个羽色的群体在c.212T＞C位点上未检测到TT型个体，在c.274G＞A位点上未检测到GG型个体；在此基础上，黑羽群体在c.637T＞C（T为有利等位基因）位点上和安义瓦灰鸡存在差异，后者还存在一定比例的C等位基因；此外，与麻羽群体（崇仁麻鸡）相比，黑羽群体在c.644A＞C（p.215His＞Pro）位点上以A等位基因为有利等位基因，未检测到CC纯合型个体。黄羽群体在MC1R基因中的检测到的变异位位点数最多（表2）；而白羽群体（泰和丝羽乌鸡）多个多态性位点（69、212、398、636、637和644）的主要基因型与黑羽群体不一致。

表2 各品种MC1R基因的变异位点基因型频率Tab.2 The genotype frequency of variation in MC1R in each tested breed

续表2 Continued table 2

表3 基于17个SNPs的MC1R基因单倍型及氨基酸替换Tab.3 MC1R haplotypes based on the 17 SNPs and amino acid substitutions

续表3 Continued table 3

2.3 MC1R基因的单倍型构建及其在江西地方鸡种中的分布频率

依据MC1R基因编码区的15个变异位点共构建了31种单倍型（H0-H30），其中H11，H14，H15，H16，H17和H27均为新发现单倍型，尚未见报道。本研究所构建的各MC1R基因单倍型的构成信息和在江西地方鸡种中的分布频率详见表3。据研究表明H0、H10、H20、H21和H28单倍型为鸡的野生型个体所具有[5,9,16]，H1-H30单倍型均是基于H0单倍型而确定。由表3可知，其中H1、H10、H27、H28和H30均只含有1个变异位点，依次分别是c.212T＞C、c.69C＞T、c.274A＞G、c.637T＞C和c.644A＞C变异位点。H2比H1多存在c.274G＞A变异位点。H2～H7的共同特征是2个错义突变位点（c.212T＞C和c.274G＞A）。其中，相比于H2，H3和H4分别还存在c.644A＞C变异位点和c.69C＞T变异位点。且基于H4单倍型，H5进一步拥有c.636G＞A和c.637T＞C变异位点，H6也进一步发现了c.637T＞C和c.644A＞C变异位点；H7比H6少拥有c.637T＞C变异位点。H8和H9都由c.69C＞T和c.644A＞C变异位点组成，两者区别在于H8多拥有c.636G＞A变异位点。H11是由1个新发现的缺失突变位点（c.547_549delAAC）和2个已发现的同义突变位点（c.69C＞T和c.486C＞T）组成的。H12比H10多表现1个错义突变位点（c.274G＞A），但H13比H12还多存在c.409G＞A变异位点。H14～H18共享已报道的c.274G＞A、c.636G＞A和c.637T＞C变异位点，其中，除共享变异位点外，H15只拥有c.398T＞C变异位点；与H15的区别在于H14、H16和H18均多拥有1个变异位点（依次是c.69C＞T、c.366C＞G和c.376G＞A），而H17是多存在2个错义突变位点（c.366C＞G和c.376G＞A）。H19～H25均发现c.636G＞A和c.637T＞C变异位点，其中H19、H21和H25分别比H20多c.398T＞C、c.552C＞T和c.427A＞G变异位点；于H21的基础上，H22和H23还共同拥有c.3334C＞T和c.552C＞T变异位点，而二者差异在于H23还发现了c.69C＞T变异位点；且H24比H25也仅多拥有c.69C＞T变异位点。H26比H25少发现c.636G＞A变异位点。H29表现2个错义突变位点，分别是c.637T＞C和c.644A＞C变异位点。

MC1R基因单倍型在333羽江西地方鸡中的分布和单倍型频率详见表4。由表4可知，黑羽群体的优势单倍型为H2和H4，其中东乡绿壳蛋鸡群体只发现1种单倍型H4，南城五黑鸡群体中发现每个个体均存在H4，余干乌骨鸡每个个体均含有H2或H4。灰羽群体（安义瓦灰鸡）的优势单倍型是H4和H5，每个个体都含有H4或H5单倍型。在崇仁麻鸡中，H7为优势单倍型，每个个体均含有H7单倍型。结合表3可知，H2、H4、H5和H7 4种单倍型中均含有共同的c.212T＞C和c.274G＞A 2个错义突变位点，相较于H2单倍型，H4增加了c.69C＞T位点，而H5又比H4增加了c.636G＞A和c.637T＞C变异位点，H7比H4增加了c.644A＞C变异位点。白羽群体的主要单倍型是H7和H15，其中泰和丝羽乌骨鸡群体发现较多单倍型，除2个主要单倍型外，其他单倍型均出现频率较低。此外，黄羽群体中的单倍型数量最多，多态性最丰富，优势单倍型主要是H0、H7、H24和H25；其中修水黄羽乌鸡群体的主要单倍型是H0、H7和H25，H24和H25单倍型在广丰白耳黄鸡群体属高频率单倍型，宁都黄鸡群体中主要发现H25，康乐黄鸡群体主要拥有H7和H25。

表4 各品种MC1R基因的单倍型频率Tab.4 Thehaplotypes frequency of MC1R in each tested breed

3 讨论与结论

本研究通过PCR产物直接测序法在333羽江西地方鸡中共发现MC1R基因突变15个，其中2个突变（c.366C＞G（p.122Ile＞Met）和c.547_549delAAC（p.183delAsn））系新发现，基于上述变异位点，共构建单倍型31条（H0-H30），其中新发现的单倍型有6条（H11、H14、H15、H16、H17和H27），MC1R基因众多的变异位点和单倍型被鉴定间接表明江西地方鸡种羽色丰富，内在遗传多样性较好。而本研究在东乡绿壳蛋鸡群体中仅构建了1种单倍型H4，一定程度上说明东乡绿壳蛋鸡的品种纯度高，这与本实验室前期通过芯片技术分析7个江西地方鸡种遗传多样性和血缘组成的结果一致[18]。

本研究中东乡绿壳蛋鸡、余干乌骨鸡和南城五黑鸡均为纯黑羽的个体，他们均共享有2个错义突变（c.212T＞C（p.71Met＞Thr）和c.274G＞A（p.92Glu＞Lys））（表2），表明上述2个位点与江西地方鸡纯黑羽的羽色形成有关。这与Kerje等[5]通过杂交实验分析发现c.274G＞A是西方鸡种纯黑羽表型形成的因果突变并不完全一致；诸多报道也表明c.274G＞A突变与家鸡黑羽密切相关[7-9,17]，而Ling等[6]发现黑色素等位基因ER只含有c.274G＞A多态性位点，而其羽色表现为大部分黑羽，非纯黑羽表型。单倍型构建结果（表3）显示同时含有上述2个错义突变位点在内的单倍型主要有6种（H2-H7）；单独含有c.212T＞C位点在内的单倍型为H1，而单独含有c.274G＞A突变在内的单倍型有7条（H12-H18）。

单倍型结果显示江西地方黑羽个体均含有H2（c.212T＞C和c.274G＞A）或H4（c.69C＞T，c.212T＞C和c.274G＞A）单倍型，二者均共享有上述c.212T＞C和c.274G＞A 2个错义突变位点，其中东乡绿壳蛋鸡已由H4固定，这与中国和日本两国的地方黑羽鸡群体的研究结果相一致[7,9-11]。相较之于东乡绿壳蛋鸡只有H4 1种单倍型，南城五黑鸡和余干乌骨鸡还分别具有其他单倍型，表明群体的遗传多样性更丰富。与H4单倍型组成相比，H3单倍型缺少了c.69C＞T位点，但同时增加了c.644A＞C（p.215His＞Pro）位点；H5单倍型组成增加了c.636G＞A和c.637T＞C（p.213Cys＞Arg）位点；H6单倍型增加了637和644位点；H7增加了637位点。崇仁麻鸡的优势单倍型为H7且每个个体都具有H7单倍型，已有的研究表明H7单倍型中的c.644A＞C（p.215His＞Pro）位点是金凤花（Buttercup）羽色鸡的特定单倍型[5]，c.644A＞C变异位点多次被报道具有抑制c.274G＞A（或c.212T＞C）变异位点的黑色素沉积作用，进而降低MC1R基因的活性与表达量，并促进褐色素的形成，最终导致羽毛颜色不呈现黑色[5,7]，而本研究中所有的黑羽个体在c.644A＞C位点上均未检测到CC突变型个体，由此可见，决定江西地方鸡黑羽表型的位点除c.212T＞C和c.274G＞A 2个错义突变外，还需关注c.644A＞C位点。

安义瓦灰鸡是近年来江西省新鉴定的资源，因其具有稀有的“瓦灰”羽色表型而著称[19]。本研究发现，所有的瓦灰鸡个体均含有H4或H5单倍型，以往报道发现c.637T＞C突变可能导致不产生cAMP信号响应α-MSH并减少真黑素生产沉积，进而出现稀释黑色素羽色，比如“灰羽”[6,8-9,20]。但本研究中，H5单倍型出现在安义瓦灰鸡群体频率较低（0.163），仅能部分解释安义瓦灰鸡的灰羽是由黑羽稀释而来，但不能完整解释灰羽表型的形成，推测可能存在其他位点能够起到稀释黑色素的功效，具体位点有待更深入的研究解析。本研究中虽然在泰和丝羽乌骨鸡中也检测到黑羽突变位点c.212T＞C和c.274G＞A，但由于TYR基因4号内含子上7.5 kb逆转录病毒序列插入造成的TYR酶丧失跨膜转运的能力，使黑色素不能沉积于羽毛组织，从而呈现出隐性白羽的表型[21]。黄羽群体中部分个体检测到H7单倍型，出现这种现象的可能原因是部分黄羽个体在颈部带有麻羽，同时部分个体尾羽中存在少量黑羽。

综上所述，本研究通过对333羽江西地方鸡种中MC1R基因的变异位点鉴定和单倍型构建，发现c.212T＞C和c.274G＞A 2个错义突变共同作用导致中国地方鸡黑羽形成；同时c.637T＞C与c.644A＞C变异位点能干扰抑制这一共同作用，前者能够对黑色进行稀释从而呈现出安义瓦灰鸡“灰羽”羽色；后者从而促进褐黑素合成，并降低真黑素的合成量，导致羽毛呈现出麻羽等类型的羽色，同时可将c.212T＞C、c.274G＞A和c.644A＞C 3个位点作为中国地方鸡黑羽分子鉴定的有效标记。

致谢：感谢江西省各地方鸡保种场对本研究中样本的支持。