抗呋喃它酮代谢物衍生物单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白表达条件的优化

陈薪竹，杜华英，洪艳平，王 丹，王玉波，杨武英，熊建华

（江西农业大学食品科学与工程学院∕南昌市农产品加工与质量控制重点实验室，江西南昌 330045）

【研究意义】呋喃它酮是一种人工合成的硝基呋喃类抗生素[1-2]。研究表明，呋喃它酮及其代谢物5-吗啉甲基-3-氨基-2-恶唑烷基酮（5-methylmorpholino-3-amino-2-oxazolidinone，AMOZ）属于强致癌物，已被禁止使用[3-6]。呋喃它酮原药在动物体内代谢迅速，但其代谢物AMOZ会与动物细胞膜蛋白形成结合态长期存留在体内难以消除[7]，人类使用此类食物后会造成潜在危害，因此代谢物的检测比原药更有意义[8-9]。受经济利益驱使，此类药物非法使用情况仍很严重，所以建立AMOZ残留的检测方法有着十分紧迫的现实意义。【前人研究进展】AMOZ残留检测常用的方法主要有仪器分析法[10-15]和免疫分析法[16-18]等。免疫分析法作为近年来发展迅速的一种快检方法，操作简单、灵敏度高，在动物性食品AMOZ残留快速筛查中优势明显。在免疫分析方法建立中，抗体质量好坏直接影响其灵敏度。单链抗体（single chain variable fragment，scFv）作为基因工程抗体，是近年来的研究热点之一，分子量小、抗原性低，可通过发酵大量生产，极大程度上弥补了传统抗体的不足[19-20]，目前已成为了应用最广泛的基因重组抗体之一。且scFv能与碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）有效结合形成融合蛋白，此融合蛋白在保留抗体分子生物活性的同时也保留了AP酶活性，在实际检测中免去了酶标二抗的使用，缩短了操作时间。【本研究切入点】本实验室已成功构建重组质粒plip6∕GN-AMOZscFv，可溶性表达载体plip6∕GN本身带有的AP酶基因，可将转入的scFv基因与载体中本身带有的AP酶基因进行融合表达，得到既具有抗体活性又保留AP酶活性的融合蛋白AMOZscFv-AP。但载体plip6∕GN的拷贝数低导致外源基因的表达量也不高，因此，优化融合蛋白的表达条件为为后期融合蛋白的大规模生产制备具有重要意义。【拟解决的关键问题】本试验对能表达抗AMOZscFv-AP融合蛋白的基因工程菌进行表达条件优化，有效提高融合蛋白在大肠杆菌中的表达量，为后期融合蛋白的大规模生产制备和基于此融合蛋白的动物性食品中AMOZ残留免疫快速筛查方法的建立奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

所选大肠杆菌E.coliBL21（DE3)、DH5α、Top10、XL1-BLUE均由本实验室保存，阴性对照质粒plip6∕GN购于BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心，阳性重组质粒plip6∕GN-AMOZscFv（氨苄青霉素抗性Ampicillin，Amp）由本实验室构建并保存[21-22]。

1.2 试验方法

1.2.1 不同宿主菌对AMOZscFv-AP融合蛋白表达量的影响 重组质粒plip6∕GN-AMOZscFv分别转化至E.coliBL21（DE3)、DH5α、Top10、XL1-BLUE后，涂布LB-Amp（100 µg∕mL）平板37 ℃培养过夜，次日挑取单菌落接种至LB-Amp（100µg∕mL）液体培养基中，37 ℃、250 r∕min条件下培养至对数期，提取质粒，经PCR、酶切鉴定后，加入IPTG（0.6 mmol∕L）诱导表达7 h，同时将plip6∕GN-BL21（DE3）设置为空菌对照。菌液离心，取沉淀加入50µL水和等体积2×蛋白上样缓冲液，煮沸10 min后利用SDS-PAGE检测融合蛋白的表达，并使用Quantity one V4.6.6软件对其表达量进行分析，优选出最适宿主菌。

1.2.2 最适培养基的选择 在最适宿主菌条件下将基因工程菌复苏培养，以10%接种量将其转接至100 mL含有Amp（100 µg∕mL）的SOB、SOC、TB、2xYT、LB、SB培养基中，培养基配方见文献[23]。37 ℃、250 r∕min条件下培养至对数期后诱导表达7 h，经SDS-PAGE分析比较融合蛋白表达量，优选出适合融合蛋白表达的最佳培养基。

1.2.3 最适培养基初始pH的选择 将基因工程菌plip6∕GN-scFv∕BL21（DE3）转接至初始pH值为6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0的最适培养基SB中，诱导表达后经SDS-PAGE分析比较融合蛋白表达量，优选出培养基的最适初始pH值。

1.2.4 诱导表达时期的选择 在确定了初始pH的SB培养基的条件下，将基因工程菌plip6∕GN-scFv∕BL21（DE3）分别培养至OD600分别为0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0，IPTG（0.6 mmol∕L）诱导7 h后，经SDSPAGE分析比较融合蛋白表达量，确定最适诱导时期。

1.2.5 诱导表达时间的选择 在最优初始pH的SB培养基的条件下，培养菌液至最适诱导时期加入IPTG（0.6 mmol∕L），分别诱导表达3，4，5，6，7，8，9，10 h后，经SDS-PAGE分析比较融合蛋白表达量，确定最佳诱导时间。

1.2.6 IPTG浓度的选择 在上述所有优选出的最佳条件下进行诱导表达剂IPTG浓度的选择，将IPTG浓度分别设为0.1，0.6，1.0 mmol∕L，诱导9 h，SDS-PAGE检测融合蛋白的表达量，考察不同IPTG浓度对AMOZscFv-AP融合蛋白表达的影响。

1.2.7 AMOZscFv-AP融合蛋白的活性检测 在上述选出的最佳表达条件下进行诱导表达，SDS-PAGE分析后转膜到硝酸纤维素膜上，以鼠抗大肠杆菌碱性磷酸酶单克隆抗体为一抗进行Western-blotting分析，同时设空载体为空白对照。采用dcELISA对诱导表达后的菌液上清中的融合蛋白进行活性检测，步骤如下:将包被抗原AMOZA-OVA用碳酸盐缓冲液（pH=9.6）稀释至1 µg∕mL后加入酶标板中，100µL∕孔，4 ℃放置过夜；PBST洗涤3次，每孔加入200µL封闭液（5%脱脂奶粉）37 ℃封闭3 h，每孔加入50µL不同浓度标准药物NPAMOZ，接着每孔加入50µL一定稀释倍数的AMOZscFv-AP融合蛋白，37 ℃下孵育45 min加入，PBST洗涤5次,加入底物溶液对硝基苯磷酸二钠100µL显色10 min，最后加入100µL 3 mol∕L NaOH溶液终止反应，于405 nm波长下测定其吸光度值。使用软件Originpro 8.5对数据进行拟合计算，并绘制其标准曲线。

2 结果与分析

2.1 最适宿主菌的选择

宿主菌的选择对菌体生长速度和后期外源基因进行表达时的表达能力有一定影响，相同载体在不同宿主菌中的表达水平会有所不同，有的甚至不表达[24]。由于plip6∕GN载体融合表达外源基因时的拷贝数一般较低，为了有效提高融合蛋白AMOZscFv-AP的表达量，本试验将重组质粒plip6∕GNAMOZscFv转化至不同大肠杆菌（E.coliDH5α、Top10、XL1-BLUE、BL21（DE3)）中进行表达，优选出最适宿主菌。4种转化菌的质粒PCR鉴定结果如图1A所示，得到了750 bp左右的scFv基因片段。酶切鉴定所用酶为BglI，plip6∕GN空载体序列中有3个BglI酶切位点，空载体经BglI酶切后有2条2 000 bp左右和一条3 000 bp左右的条带，在电泳图中2 000 bp处的条带会更亮，plip6∕GN-scFv重组质粒经BglI酶切后有一条2 000 bp左右和2条3 000 bp左右的条带，在电泳图中3 000 bp处条带会更亮，由图1PCR、酶切鉴定结果可知结果正确。说明plip6∕GN-scFv重组质粒已成功转化至4种大肠杆菌中。经诱导表达后观察SDS-PAGE结果发现，在选择的4种宿主菌的蛋白表达物中均出现了AMOZscFv-AP融合蛋白的表达条带（图2A），条带大小约为55～70 ku。利用软件Quantity one V4.6.6分析得到宿主菌E.coliBL21（DE3）中的表达水平最高约达7.94%（图2B），所以将E.coliBL21（DE3）作为最适宿主菌。这可能是因为宿主菌BL21（DE3）为载体plip6∕GN上的增强子和启动子提供了其所需的特异性结合蛋白，且菌内的生长环境有利于此类融合蛋白的表达、积累。

图1 重组质粒PCR鉴定（A）和酶切鉴定结果（B）Fig.1 Identification of the recombinant plasmid Plip6∕GN-scFv by PCR（A）and restriction enzyme digestion（B）

图2 宿主菌对AMOZscFv-AP融合蛋白表达量的影响Fig.2 Effect of host bacteria on the expression of AMOZscFv-AP fusion protein

2.2 培养基对AMOZscFv-AP融合蛋白表达量的影响

菌体在生长过程中，培养基为其提供了生长所必需的营养成分，同一菌体在营养成分不同的培养基中，其生长状态存在着较大差异[23]。通常，细菌在营养成分充足的培养基中更容易生长，且融合蛋白的表达更好。对比6种不同培养基对AMOZscFv-AP融合蛋白表达量的影响，由图3可得，相比其他5种培养基，由SB培养基培养的基因工程菌plip6∕GN-scFv∕BL21（DE3）经诱导后，AMOZscFv-AP融合蛋白的表达水平最高，利用软件Quantity one V4.6.6分析其表达量约达9.09%。SB培养基和LB培养基都是由胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠组成，但对比各组分含量发现，SB培养基中酵母提取物浓度比LB培养基高2倍。所以将SB培养基作为发酵培养基。

图3 不同培养基对AMOZscFv-AP融合蛋白表达量的影响Fig.3 Effect of different media on the expression of AMOZscFv-AP fusion protein

2.3 培养基初始PH对AMOZscFv-AP融合蛋白表达量的影响

菌株在培养基中生长时，除培养基的成分会影响菌体生长外，培养基的初始pH值也与菌体的生长代谢有着密切相关的联系。pH值不同，往往会引起菌体代谢过程的不同。pH偏离太大时，菌体中各种酶的活性会受到影响，进而妨碍了菌体的新陈代谢；而且会调度微生物细胞膜原本的电荷状态，使细胞膜的通透性发生变化，影响微生物代谢产物的排泄及某些组分的解离，从而导致目的蛋白的表达发生差异[25]。通常，发酵培养基初始pH值在6.8～7.6范围内时适合菌体的生长代谢。由图4可知，将SB培养基的初始pH调整到6.8～7.0时，融合蛋白AMOZscFv-AP的表达水平最高，表达量经软件Quantity one V4.6.6分析其约达9.71%。之后，随着pH值的不断增高，融合蛋白的表达量逐渐呈下降趋势。因此，当SB培养基初始pH为7.0时更适合外源蛋白AMOZscFv-AP表达。

图4 不同培养基初始PH对AMOZscFv-AP融合蛋白表达量的影响Fig.4 Effect of initial pH of media on the expression of AMOZscFv-AP fusion protein

2.4 诱导时期对AMOZscFv-AP融合蛋白表达量的影响

对于通过热诱导方式来实现目的蛋白表达的工程菌来说，过早进行诱导表达，菌液中不仅菌体含量少，且目的蛋白的表达量很低；过晚诱导表达，菌体细胞的生长代谢已趋于缓慢、酶活性也明显降低，从而也会导致表达量明显下降[26]。当菌体细胞处于对数期时，菌体内的转录和翻译酶体系生长代谢极为旺盛，此时期适合进行蛋白表达。如图5所示，在不同OD值下进行诱导表达的蛋白表达水平各有差异，当OD600为0.6时，外源基因进行蛋白表达其表达量最高约达10.5%，随后蛋白表达量逐渐呈下降趋势。因此，当OD600为0.6即对数生长前期时进行诱导表达最好。

图5 不同诱导时期对AMOZscFv-AP融合蛋白表达量的影响Fig.5 Effects of different induction periods on the expression of AMOZscFv-AP fusion protein

2.5 诱导时间对AMOZscFv-AP融合蛋白表达量的影响

IPTG作为一种诱导外源基因表达的诱导剂，与乳糖操纵子作为启动子不同的是，IPTG不会被细胞代谢掉，且在结构上与乳糖相似，因此它可以实现蛋白质的持续表达。但IPTG诱导蛋白质表达时间的长短对蛋白表达量有着直接影响，诱导时间过短，其目的蛋白量就少；诱导时间过长，其表达量增高不明显，耗费时间和能源[27]。为了探究不同诱导时间后的蛋白表达量情况，本试验选择了8个不同诱导时间来观察其差异。如图6所示，随着诱导时间的增加，蛋白表达量也呈逐步上升的趋势，诱导9 h后，表达量趋于平稳。因此，可确定融合蛋白AMOZscFv-AP的最佳诱导时间为9 h。

图6 不同诱导表达时间对AMOZscFv-AP融合蛋白表达量的影响Fig.6 Effect of different induction expression time on the expression level of AMOZscFv-AP fusion protein

2.6 诱导剂浓度对AMOZscFv-AP融合蛋白表达量的影响

IPTG本身是有一定毒性的，当IPTG浓度过高时，不仅不利于蛋白表达，而且还会产生毒性破坏菌体的生长[28-29]。为了探究不同IPTG浓度对AMOZscFv-AP融合蛋白表达量的影响，将IPTG浓度分别设为0.1，0.6，1.0 mmol∕L，结果如图7所示，当诱导表达9 h后，不同IPTG浓度下诱导后均在70 ku左右出现了明显的目的条带，0.6 mmol∕L浓度下诱导表达的蛋白量较高，但差异并不明显。因此，选择浓度为0.6 mmol∕L的IPTG进行诱导表达。

图7 不同IPTG诱导浓度对AMOZscFv-AP融合蛋白表达量的影响Fig.7 Effect of different IPTG concentrations on the expression of AMOZscFv-AP fusion protein.

2.7 融合蛋白的活性鉴定

在上述优选出的最佳表达条件下进行诱导表达，然后进行SDS-PAGE和Western-blotting分析。因为AMOZscFv蛋白分子量为20～30 ku，AP酶分子量为50～60 ku，所以AMOZscFv-AP融合蛋白分子量约为70 ku。SDS-PAGE结果如图3A（1）所示，与plip6∕GN∕BL21（DE3）对照菌相比，plip6∕GN-scFv-phoA∕BL21（DE3）工程菌在分子量55～72 ku处出现一条新生蛋白带，该条带就是AMOZscFv-AP融合蛋白，经软件Quantity one V4.6.6分析得到该条带的表达水平达11.45%，比表达条件优化前的表达量（7.94%）增加了3.51%，有效提高了表达量。Western-blotting结果如图3A（2）所示，转印硝酸纤维素膜后plip6∕GNscFv-phoA∕BL21（DE3）菌体总蛋白泳道50～70 ku处出现明显的AMOZscFv-AP融合蛋白印迹条带。以标准药物NPAMOZ浓度的对数为横坐标，B∕B0为纵坐标（B表示不同药物浓度下的OD405，B0表示不加药物时的OD405），得到dcELISA标准曲线（图3B），通过软件Originpro 8.5拟合计算得到IC50值和最低检测限LOD值分别为10.62 ng∕mL、4.83 ng∕mL，这说明在上述优选的表达条件下诱导表达得到的AMOZscFv-AP融合蛋白具有良好的生物活性。

图8 AMOZscFv-AP融合蛋白的SDS-PAGE、Western-Blot（A）鉴定和NPAMOZ的dcELISA标准曲线（B）Fig.8 Identification of the AMOZscFv-AP fusion protein by SDS-PAGE，Western Blot（A）and dcELISA standard curve of NPAMOZ（B）

3 讨论

单链抗体常用的表达系统为原核表达系统，表达形式包括包涵体表达和可溶性表达。包涵体表达的蛋白表达量高，但其需要蛋白变性、复性等步骤，操作繁琐，且蛋白经变性、复性后活性会受到一定的影响；与包涵体表达相比，可溶性表达不需要蛋白变性、复性等操作，直接在菌液上清和周质腔里表达出了有活性的目的蛋白，其表达量虽没有包涵体表达的产量多，但这不会对目的蛋白的生物学活性造成影响[30]。在前期工作中，笔者将构建好的抗AMOZ衍生物单链抗体（AMOZscFv）基因转入PET-22b（+）载体并在大肠杆菌中进行了表达，得到的是包涵体表达的带His标签的scFv，需要经过变性、复性后才能得到具有活性的抗体蛋白，基于此蛋白建立的免疫检测方法都为间接竞争免疫分析方法[21-22]。

本试验所用的plip6∕GN表达载体是一种可溶性表达载体，AMOZ-scFv基因能与表达载体中的AP酶基因进行可溶性融合表达，此融合表达后的蛋白既有抗体活性又保留了AP酶的活性，基于此融合蛋白建立的免疫检测方法都为直接竞争免疫分析方法，和基于包涵体抗体蛋白建立的间接竞争免疫分析方法相比，免去了酶标二抗和抗His标签抗体的使用，还省略了这2种抗体加入后的洗涤步骤，大大节省了检测时间，提高了检测效率。但是AMOZ-scFv基因在plip6∕GN表达载体中融合表达时的拷贝数不高，为了有效提高此融合蛋白的表达量，本试验对融合蛋白AMOZscFv-AP在大肠杆菌中可溶性表达的条件进行了优化，将重组质粒plip6∕GN-AMOZscFv转化至不同大肠杆菌中，确定最适宿主菌，然后分别研究不同培养基、不同培养基初始pH、不同诱导时期、不同诱导时间和不同浓度蛋白诱导表达剂IPTG对最适宿主菌中融合蛋白表达的影响。结果表明以初始pH为7.4的SB培养基为发酵培养基、在对数生长前期即OD600为0.6时采用浓度为0.6 mmol∕L的IPTG对融合蛋白AMOZscFv-AP进行诱导表达，诱导表达9 h，融合蛋白表达量约达11.45%，成功提高了抗AMOZ单链抗体在大肠杆菌中的可溶性表达量，为后期AMOZscFv-AP融合蛋白的大规模生产制备和基于此融合蛋白的动物性食品中AMOZ残留免疫快速筛查方法的建立奠定了良好的实验基础，具有较好的应用前景。