性别分子标记在毛花猕猴桃中的通用性验证

吕正鑫，刘 青，廖光联，2，黄春辉，贾东峰，徐小彪，2*

（1.江西农业大学农学院∕猕猴桃研究所，江西南昌 330045；2.江西农业大学林学院，江西南昌 330045）

【研究意义】毛花猕猴桃（Actinidia erianthaBenth.）为猕猴桃科（Actinidiaceae）猕猴桃属（Actinidia）雌雄异株的多年生藤本果树，作为我国特有的猕猴桃种质资源，在长江以南200～1 000 m海拔处的山区广泛分布[1]。目前世界猕猴桃的主栽品种比较单一，随着猕猴桃产业的发展，消费水平的升级，培育新的栽培品种具有重要意义[2]。毛花猕猴桃果实维生素C含量为中华猕猴桃的3～4倍[3]，且具有抗逆性强、富含矿物质及风味好、口感佳等优点，有巨大的发展潜力，是潜在的优质猕猴桃种质资源选育的新品种[4]。雌雄异株现象在果树作物中普遍存在，植株自身的经济价值往往因性别的差异而有很大不同。从形态学上看，猕猴桃科（Actinidiaceae）为功能性雌雄异株植物，目前生产上以雌株果实产生经济价值，其经济价值明显高于雄株，雄株在生产上多作为授粉配对用树，虽然雄花的花青苷含量较高、花色明艳、具有一定观赏价值，但现阶段毛花猕猴桃的育种工作仍集中在优质雌株的选育方面。猕猴桃实生育种过程中童期较漫长，一般为5～7 a[5]，雌雄异株和幼苗期的性别很难分辨，对品种改良和育种工作造成阻碍。因此，对幼苗早期性别鉴定技术的研究将在极大程度上节约育种成本并缩短育种周期，在生产和遗传育种上都有重要意义。【前人研究进展】前人尝试利用形态学[6]、生理生化[7]和同工酶[8]等方法鉴别猕猴桃的性别，但常因环境因素的影响导致结果准确度不高，随着分子生物学的发展，利用分子标记技术在基因层面鉴定亲缘关系的方法越来越受到学者们的青睐。SSR（simple sequence repeat）分子标记以个体间核苷酸序列变异为基础，可直接反映出生物个体遗传变异，可以检测出生物个体之间在核苷酸序列水平上的差异[9]，极大降低了环境因素的干扰，目前已在遗传多样性分析、指纹图谱构建及分子标记辅助育种等各个方面有广泛的应用[10]，在猕猴桃等雌雄异株植物中可有效鉴定早期性别。目前，在开发猕猴桃属植物性别鉴定分子标记的研究上取得了一些进展，但暂未有毛花猕猴桃上的相关报道。使用山梨猕猴桃（Actinidia rufa）和中华猕猴桃（Actinidia chinensisPlanch.）原变种的种间杂交后代F1群体进行试验，在174个F1代个体中进行验证，利用RAD-seq技术开发的SSR（simple sequence repeats）标记，最终筛选出A001、A002和A003这3个有较好特异性的分子标记；A001为雌性特异标记，具有较高的鉴定准确性；A002和A003在雌、雄个体中均具有良好的差异性及多态性，可用于植株性别的鉴定；A003能够区分山梨猕猴桃和中华猕猴桃原变种；组合使用A001和A002这2个标记可有效鉴定中华猕猴桃和山梨猕猴桃性别[11]。UDK96-009、UDK96-013、UDK96-019、UDK97-404及UDK97-408为‘和平红阳’猕猴桃上筛选出的在雌、雄株上表现出良好的差异性及多态性的SSR标记，其多态性百分比均在88.9%以上，可鉴定植株性别[12]。

【本研究切入点】目前标记A001、A002和A003不仅在前人研究所涉及的材料中进行了应用验证，在其它品种如软枣猕猴桃上也已进行了通用性验证[13]，其余标记目前尚未有在其它栽培种类上的通用性验证。【拟解决的关键问题】目前关于毛花猕猴桃性别标记的报道较少，本试验利用已知性别的野生毛花猕猴桃种质资源作为材料，旨在探讨A001、A002、A003和UDK96-009、UDK96-013、UDK96-019、UDK97-404、UDK97-408两组分子标记在毛花猕猴桃性别鉴定中的通用性，以期为毛花猕猴桃育种群体的早期性别分子鉴定提供快捷、高效的方法，优化生产上早期的雌雄配比，加快育种进程。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验于2018—2019年进行，材料来自江西省麻姑山，采用已知性别的毛花猕猴桃样品10份（雌、雄各5株）。选择标准为树势较强、生长结果正常的成龄植株，采下其一年生枝蔓上的幼嫩叶片置于冰盒，随后立即带回实验室，转移至装满吸水硅胶的自封袋中，充分脱水干燥后保存待用。

1.2 标记来源

A001、A002及A003来自Zhang等，UDK96-009、UDK96-013、UDK96-019、UDK97-404及UDK97-408来自杨妙贤等，所用引物由上海生工生物工程有限公司合成提供，引物信息具体见表1。

1.3 DNA提取

使用北京华越洋生物科技有限公司生产的植物基因组DNA快速提取试剂盒，改良后的CTAB法提取DNA，选取猕猴桃雌雄株幼嫩叶片，放入自封袋中用硅胶充分脱水干燥，称取叶片100～200 mg，用磨样机研磨至细粉状。具体提取步骤均参照试剂盒说明书进行。所得DNA使用紫外分光计进行检测，并配合1%（ω）琼脂糖凝胶电泳法检测其质量及完整性是否合格。将模板DNA质量浓度稀释至20 ng∕mL，保存于-20 ℃备用。

1.4 PCR扩增

PCR扩增程序:94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，47～64 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共28～34个循环，最后72 ℃延伸10 min于12 ℃保存。对不同引物的退火温度进行多次检验，筛选出最佳退火温度，以期每个标记所对应的产物中能产生清晰且长度一致的多态性条带。PCR扩增产物采用8%（ω）非变性PAGE电泳，快速银染法对条带进行检测，拍照记录后进行分析。

表1 8个猕猴桃性别标记引物信息Tab.1 Information of eight kiwifruit gender marker primers

2 结果与分析

2.1 A001、A002和A003标记在毛花猕猴桃样品中的验证结果

A001和A002 2个标记在10个已知性别的毛花猕猴桃雌雄样品基因组DNA中的扩增结果显示，在A001和A002的扩增产物中均出现了多态性条带，但并未在雌雄株之间发现明显的规律，即2个标记对毛花猕猴桃种质资源均未能表现出性别特异性（图1a）；对A003标记的扩增结果进行观测分析，未能检测出清晰的多态性条带（图1b）。

图1 A001、A002和A003标记的验证结果Fig.1 The outcome of A001，A002 and A003

2.2 UDK96-009、UDK96-013等5个标记在毛花猕猴桃样品中的验证结果

在对毛花猕猴桃基因组DNA扩增最适退火温度的多次检验后，UDK96-009标记均无法检测出清晰的多态性条带，结果与A003标记结果类似，无良好多态性；UDK96-013和UDK96-019标记的扩增产物中均出现了多态性片段，但并未在雌雄株之间发现明显的规律，即2个标记对毛花猕猴桃种质资源均未能表现出性别特异性（图2a）；UDK97-404和UDK97-408标记分别在退火温度为52 ℃和64 ℃时部分样品扩增出少量多态性条带（图2b），无良好多态性。

图2 UDK96-013、UDK96-019和UDK97-404、UDK97-408标记的验证结果Fig.2 The outcome of UDK96-013，UDK96-019 and UDK97-404，UDK97-408

3 讨论

对猕猴桃早期性别鉴定方法的研究在实践中有重要意义，作为雌雄异株的经济作物，猕猴桃雌株产生的经济价值往往远高于雄株，但因其童期较长且到达丰产的成熟期过长[5]，导致早期雌、雄株很难分辨，所以在生产上合理配置雌雄个体对提高产量及经济效益显得尤为关键。毛花猕猴桃的雄株相较于其它品种猕猴桃雄株不仅具有授粉的传统作用，更具有花色艳丽、花青素含量高的特点[14]，在实际生产中可作为观赏花推广，其花瓣中富含的花青素在抗氧化、抗癌及预防慢性代谢性疾病等方面有着良好的功效[15]。王金硕等[16]在对雄性软枣猕猴桃的研究发现，合理配置雄株具有确保产量、增加果实大小、减少畸形果和提高果实品质等优点，所以合理配置雄株，可进一步提高其经济价值。

目前对猕猴桃性别鉴定的方法主要有形态学标记、生理生化、同工酶鉴定和DNA分子标记等。形态学鉴定主要通过对生殖器官的研究进而区分雌雄株，观察雌雄株独有的器官或观察其在发育过程中的独特变化进而判断性别，对软枣猕猴桃和狗枣猕猴桃的生殖器官进行形态学解剖，发现其雌花中的雄蕊退化，雄花中的雌蕊退化，但总体上雌花与雄花在表型上非常相似[17]；软枣猕猴桃雌株叶痕间距和皮孔密度显著大于雄株，而枝条颜色、横切解剖结构、叶柄粗细长短和叶纵横径之比均未出现显著差异[6]。生理生化是以雌雄植株在新陈代谢、特异蛋白质和生理指标等方面所体现出的差异为依据，对差异的分析鉴定雌雄株性别的一种方法，李旭等[6]通过BTB法、TTC法和总酚含量测定等方法，测定软枣猕猴桃雌雄株在生理生化上的差异，在芦笋[18]、栝楼[19]、杨梅[20]和复叶槭树[21]等植物上有相似结果，但这些方法目前只应用在成熟植株上，对童期植株是否使用还有待进一步研究。同工酶属于分子水平的指标，雌雄株间的某些本质差异可以通过其得以表现，这种方法通过对组织、发育及物种之间的特异性的检测分析，找出编码相应酶的等位基因间的差异[22]，因此同工酶是基因差异在表达水平的体现。如陈晓玲等[23]采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，对6个猕猴桃品种雌雄株的酯酶同工酶和过氧化物酶进行检测分析后发现，两者在不同猕猴桃品种中均存在一定差异，但对雌雄株进行酶谱分析时无特征条带出现，同工酶在鉴别猕猴桃性别的研究上目前依旧主要集中在成熟植株上，童期植株的适用性鲜有研究。DNA分子标记（DNA molecular markers）是DNA水平遗传变异的直接反映，与其它方法相比，具有采样要求低、测定结果易标准化和鉴定结果准确性高等优点[24]，目前RAPD、SCAR和AFLP等DNA分子标记常被用于猕猴桃性别鉴定研究，通过PCR技术与群体分离分析方法（Bulked Segregant Analysis，BSA）的结合，可在早期对雌雄异株植物的性别进行鉴定，其方法是根据目标性状将分离群体分为2组，构建在目标基因区段存在差异的2个基因混合池，提取基因池中DNA作为模板进行RAPD分析，2个基因混合池间多态性有差异的标记与目的基因必定产生关联，Gill等[25]使用该方法开发出可用于鉴定中华猕猴桃原变种为亲本的3个家系（包括亲本及其产生的F1代）的SmY1和SmX，在马尾藻、巨体舌鱼和黄连木的性别鉴定研究中均有应用这种BSA混池测序技术，有较好的通用性。通过RAD-seq基因图谱技术得到了本试验所使用的A001、A002和A003这3个SSR分子标记，该技术能有效检测DNA多态性，且可对基因组序列尚不清楚的物种进行检测，大多数模式生物及部分非模式生物都有应用，如开心果和西瓜等。除本试验中所选用的8个标记，已开发出可用于鉴定中华猕猴桃原变种和美味猕猴桃原变种植株性别的RAPD标记S1032-850，但其尚未转化为相对更稳定、准确率更高的SCAR标记[26]，所以本文并未对其在毛花猕猴桃中的通用性进行验证。

目前对猕猴桃性别鉴定方法的研究主要集中于上述几种方法，随着分子研究技术的不断进步，对性别分化相关基因的研究不断深入，性别鉴定的研究深度便捷度、和准确度都有了很大的提升。植物体中的微RNA（microRNA miRNA）长约21 nt，通过转录后基因调控的方式参与调节多种植物发育和内外应答反应，如花器官发育和花的性别分化等[27]。近年来，基于miRNA深度测序研究基因功能已在木瓜[28]、玉米[29]和杨树[30]等多种植物之中都有应用。闫明科等[31]运用高通量测序技术及生物信息学进行分析，对猕猴桃雌、雄花中表达的小RNA（sRNA）进行鉴定，得出其中进化上保守的miRNA，推测出新的雌、雄花特异miRNA，筛选出一批差异表达的miRNA并预测了其靶基因，从遗传学角度为猕猴桃雌、雄株的性别分化研究奠定基础[31]。但有研究表明，植物的性别并不绝对取决于其遗传因子，植物激素和表观遗传修饰等因素也在一定程度上产生影响，因素之间相互独立又共同作用，在以花为主的被子植物生殖器官表型上这些因素的作用结果得到表现，使得性别表型产生多样性。猕猴桃染色体倍性复杂，如中华猕猴桃主要为二倍体和四倍体[32]，美味猕猴桃倍性较多，有四倍体、五倍体和六倍体[33]，毛花猕猴桃几乎均为二倍体[34]。从遗传学角度来看，猕猴桃杂交后代群体的性别分化符合XY型性染色体性别决定系统[35]；对核型的进一步观察[36]和多基因连锁图谱的构建[37]，发现中华猕猴桃的XY染色体的长度及外观形态非常类似，在被子植物性染色体进化的六个时期中[38]的第二个时期，Y染色体上的亚端粒部位存在某些性别决定位点不能与X染色体自由重组，而这些缺乏重组的位点正是性别决定部位的特点[39]，同时在原始Y染色体上有一个小的雄性特异区形成，并且出现了全雄及全雌植株。据此发现，猕猴桃的性别分化表现与芦笋类似，认为猕猴桃的性染色体应处于进化阶段的第二个时期，此时Y染色体未能进化完全，仍处于处于早期进化阶段。文中所使用的8个标记均在中华猕猴桃原变种中得到验证，但在毛花猕猴桃上不具通用性，推测与以上原因有关，认为毛花猕猴桃可能在性别特异区域位置或序列上与原文研究的猕猴桃品种有差异所导致。

此外，在其它雌雄异株植物上也有诸多性别标记的报道，如杜仲[40]、甜瓜[41]和柿[42]等都已开发出一系列用于鉴定性别的标记。本文所使用的8对标记均未有效鉴别出毛花猕猴桃的性别，分析认为是猕猴桃性别决定符合孟德尔遗传定律，表现为单基因控制的特点，但是现有研究仍然没有找到猕猴桃性别决定相关的QTL。目前已有报道的的性别决定相关marker在猕猴桃属不同种间存在局限性，因而，除了已报道的若干种外，其它猕猴桃种的性别鉴定需要开发新的分析标记。随着分子生物技术的不断进步，今后猕猴桃性别鉴定的研究也会更倾向于基因层面，但在探明其性别表型形成的机理之前，利用多种鉴别方法相结合进行性别鉴定，可在育种早期高效、精准的鉴定性别，可降低育种成本，加快田间育种进度，在发育早期更合理的配置雌雄植株，降低不必要的损耗，更好更快地促进育种产业的发展，为实现可持续发展做出保障。