发酵剂对羊肉干中亚硝酸盐、亚硝胺残留量与风味物质的影响

刘建林，孙学颖，刘志鹏，赵丽华*，靳 烨，赵富元

（1 内蒙古农业大学食品科学与工程学院 呼和浩特010020 2 内蒙古蒙元宽食品有限公司 内蒙古巴彦淖尔015000）

发酵肉干是指将背最长肌切成约5 cm×5 cm的肉条，在自然或人工控制条件下，经自然或添加外源发酵剂，利用微生物或酶的发酵作用，发酵、干燥熟制而成的一类具有特殊风味、色泽和质地，且具有较长保藏期的肉制品[1-2]。其在生产过程中应用生物工程中的微生物发酵工程，相比传统肉制品其具有营养丰富、风味独特、保质期长三大主要特点。

肉制品在加工过程中常会添加硝酸盐及亚硝酸盐类，这类物质不仅使肉制品在加工过程中形成特有风味，还起到发色和防腐的作用[3]。然而，肉制品中亚硝胺的产生与添加的亚硝酸盐密切相关，食物中的亚硝酸盐和二级胺在弱酸性条件下（胃酸）反应生成“N-亚硝胺”，该物质为公认的强致癌物[4-5]。Hustad 等[6]对添加的亚硝酸钠和残留的亚硝酸钠与生成的亚硝胺的含量进行研究，结果表明，随着亚硝酸钠添加量的增加，相对应的亚硝胺生成量亦提高。

发酵肉制品的典型品质及良好风味组成源于发酵成熟期间的理化、生化及微生物的变化。蛋白和脂质的氧化水解是发酵肉制品中营养因子和重要风味物质的主要来源，在发酵成熟过程中，其被微生物酶及肉内源酶分解为游离氨基酸和脂肪酸，既可提供人体所需氨基酸和脂肪酸等营养因子，也易通过氧化、分解和Strecker 反应及美拉德反应生成决定香肠品质的主要风味物质[7-8]。

刘兰[9]探究不同发酵剂对发酵牛肉干品质的影响结果表明，乳清+发酵剂可降低成品中亚硝酸盐的含量，提高挥发性风味物质的种类；辛晓琦等[10]研究戊糖片球菌37X-8 对发酵羊肉香肠中亚硝酸盐和亚硝胺含量变化的影响，发现添加发酵剂对亚硝酸盐和亚硝胺的抑制作用比未添加更为明显；王德宝等[11]通过接种清酒乳杆菌与木糖葡萄球菌，探究不同发酵剂对羊肉发酵香肠中的蛋白质、脂质代谢与挥发性风味物质形成的影响，发现添加复合发酵剂有助于改善香肠风味感官品质。

本文选择天然乳清和复合菌株 （木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌、戊糖片球菌和植物乳杆菌比例为1∶1∶2∶1）为发酵剂，制作发酵羊肉干，探究不同发酵剂对发酵羊肉干中亚硝酸盐、亚硝胺残留量及风味物质形成的影响，以期为实际生产应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料、试剂与仪器

原辅料：羊肉背最长脊，巴盟察右中旗放牧羊；食盐、酱油、葱、姜、孜然、白砂糖、葡萄糖、亚硝酸钠均为市售食品级。

发酵剂：乳清，内蒙古蒙元宽食品有限公司；复合发酵剂（107CFU/g，木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌、戊糖片球菌和植物乳杆菌比例为1∶1∶2∶1），木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus），中国工业微生物菌种保藏中心；肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus），广东省微生物菌种保藏中心；戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus，37X-3）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum，37X-6），内蒙古农业大学肉品微生物实验室。

试剂：甲醇（色谱纯），赛默飞世尔科技（中国）有限公司；亚硝胺标准品，美国Sigma 公司。

仪器：恒温恒湿箱（ZXMP-A1430），上海智城分析仪器制造有限公司；UV-1800 型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；色谱-质谱联用仪（Trace ISQ），赛默飞世尔科技；高效液相色谱仪（Agilent 1260vwd），安捷伦有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 发酵肉干的制作 羊背最长肌1 kg、食盐5 g/kg、葡萄糖1 g/kg、白砂糖5 g/kg、酱油5 g/kg、葱5 g/kg、姜5 g/kg、孜然5 g/kg、亚硝酸钠2 mg/kg、乳清2%、复合发酵剂2%。工艺条件如表1所示。

表1 发酵羊肉干工艺条件Table 1 Fermented mutton jerky processing conditions

1.2.2 试验设计 试验共分为4 组：对照组；复合发酵剂组（木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌、戊糖片球菌和植物乳杆菌）；乳清组；乳清+发酵剂组。然后取不同阶段：0 d（腌制阶段），2 d（发酵阶段），4 d（干燥阶段），5 d （烤制阶段） 的样品进行亚硝酸盐、亚硝胺指标测定，取成品样进行风味指标测定。样品于-80 ℃下保存备用。

1.3 亚硝酸盐的测定

参照《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》（GB 5009.33-2016）[12]方法测定肉干亚硝酸盐残留量。

1.4 亚硝胺的测定

参照温演庆等[13]的方法测定，并做适当调整。称取样品2 g 置于150 mL 三角瓶中，加入甲醇30 mL，摇匀，确保试样完全被浸湿，于40 ℃超声水浴萃取20 min，用玻璃GI 砂芯漏斗过滤至100 mL圆底烧瓶中，再加入甲醇20 mL，于40 ℃超声水浴萃取10 min，过滤后合并滤液，收集的滤液置于真空下浓缩至近干，准确移取2 mL 甲醇加入浓缩至近干的圆底烧瓶中，混匀静置，经0.45 μm 的有机过滤膜过滤后，置于样品瓶中，上机测定。

1.5 风味测定

参照罗玉龙等[14]的方法稍作改动。采用固相微萃取法处理样品。取6 g 样品置于20 mL 顶空瓶中压盖，将老化后的SPME 萃取头插入样品瓶顶空部分，于60 ℃吸附50 min，吸附后的萃取头取出后插入气相色谱进样口，于250 ℃解吸3 min，同时启动仪器采集数据。

气相色谱条件：使用DB-5 毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），以氦气载气流速1 mL/min，进洋口与接口温度为250 ℃，不分流方式为进样模式。

升温程序：采用三段式升温程序，第1 阶段起始温度40 ℃，以4 ℃/min 的速度升温至150 ℃，持续3 min；第2 阶段从150 ℃升温至200 ℃，速度为5 ℃/min，保持1 min；第3 阶段以20 ℃/min 的速度从200 ℃升温到230 ℃，时间为5 min。

质谱条件：采用EI 离子源为电离方式，电离电压为70 eV，离子源温度250 ℃，传输线温度250 ℃，扫描质量范围30～400 m/z，溶剂延迟时间为1 min。

由表1可知，实验前，实验组和对照组群体任务凝聚力均值及各维度均值均较高于相应的中间值，群体交往凝聚力均值及各维度均值均较低于相应的中间值；实验组、对照组的群体任务凝聚力和群体交往凝聚力经t检验均存在显著性差异(p<0.05)。实验组总体凝聚力只是单纯的任务凝聚力，成员间不熟悉，交流不多，体现在成员只为完成学习任务的行为表现；对照组总体凝聚力体现在成员能够积极地完成教学任务，但都专注于自己的事情，成员之间缺乏交流、沟通。此时，实验组和对照组凝聚力水平都很低。

定性与定量分析：将总离子流色谱图中的每个峰与NIST、WILEY 和MENALIB 数据库中已知物质的质谱数据进行检索定性，以匹配度大于800 为鉴定依据。根据峰面积归一法计算每种风味化合物的相对百分含量，单位为AU/g。

1.6 统计分析

本试验每个数据设置3 个重复。图表绘制采用Origin Pro 2018，数据显著性分析选用SPSS 8.0 软件完成。所有数据表示为“平均值±标准差”，平均值采用Duncan 氏法进行多重比较，显著水平为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 不同发酵剂对发酵羊肉干亚硝酸盐（NIT）残留的影响

发酵肉制品中亚硝酸盐的主要来源是微生物的代谢产生以及外源添加[15]。由图1可知，4 组发酵羊肉干的亚硝酸盐含量均呈先下降后升高的趋势。在腌制阶段，乳清组显著低于发酵剂组和乳清+发酵剂组（P＜0.05），乳清+发酵剂组显著高于对照组和乳清组（P＜0.05），这可能是由于在腌制过程中，原材料搅拌不均匀导致香肠中亚硝酸钠残留量不同[16]。发酵阶段结束后各组的亚硝酸盐残留量达到最低，其中乳清组（0.85 mg/kg）显著低于其它3 组（P＜0.05），一方面可能是由于乳清组中含有大量的乳酸菌，并且乳酸菌菌株多样，在此阶段其pH 值刚好达到亚硝酸盐还原酶的最适pH值范围，从而发挥了较好的酶降解作用；另一方面可能是由于亚硝酸钠产生的游离亚硝酸分解生成NO 与肌红蛋白结合，形成稳定的亚硝基肌红蛋白（呈玫瑰红色），从而使得乳清组的亚硝酸盐含量达到最低[16-17]；也有可能由于在发酵肉干中添加了食盐，使原料肉中的盐离子浓度升高，高浓度食盐、氨基酸和肌红蛋白与酸性环境等因素结合，使亚硝酸盐的含量降低[12]。在烤制结束后，试验组亚硝酸盐含量均显著降低（P＜0.05），乳清组（1.86 g/kg）显著低于其它3 组（P＜0.05）。各组肉干的亚硝酸盐含量均小于国家规定的30 mg/kg。

2.2 不同发酵剂对发酵羊肉干亚硝胺残留的影响

由图2可知，羊肉干在发酵结束后，各组亚硝胺含量显著升高，试验乳清组的亚硝胺含量为35.14 μg/kg，显著低于其它3 组（P＜0.05），可能是由于在发酵过程中乳清组存在大量乳酸菌使得pH 值降低，促进了亚硝酸盐的还原作用，使得亚硝酸盐分解，大大降低了它的残留量，从而进一步减少了亚硝胺的含量[18]；另一方面可能是由于肉干中的蛋白质没有被降解为亚硝胺的前体物质氨基酸和胺，从而减少了亚硝胺的合成。在干燥结束后，乳清+复合发酵剂组的亚硝胺含量为14.35 μg/kg，显著低于其它3 组（P＜0.05）。而在烤制结束后，4 组羊肉干中的亚硝胺含量大幅增加，可能是由于羊肉干中的脂肪在高温条件下烤制，加快了亚硝基化反应进行的速率，并在高温下导致菌失活进而造成烤制结束后亚硝胺含量明显上升[19]。成品中乳清组的亚硝胺含量（110.61 μg/kg）显著低于其它3 组（P＜0.05），从而使得亚硝基化反应进行的速率降低。

图1 不同发酵剂对发酵羊肉干中亚硝酸盐含量变化的影响Fig.1 The effects of different fermentation agents on the change of nitrite content in fermented mutton jerky

图2 不同发酵剂对发酵羊肉干中亚硝胺含量变化的影响Fig.2 The effects of different fermentation agents on the change of nitrosamine in fermented mutton jerky

2.3 不同发酵剂对发酵羊肉干成品风味物质形成的影响

发酵肉制品中的风味物质主要源于蛋白质及脂质的氧化分解，如氨基酸Strecker 降解、脂质氧化及美拉德反应构成风味物质生成主要途径[8]。由表2可知，发酵羊肉干成品中共检测出主要挥发性风味物质29 种，对照组21 种；发酵剂组和乳清+发酵剂组22 种；乳清组23 种挥发性成分，其中醛、醇、酮类物质各3 种，酸类5 种，烃类4 种，其它为5 种。通过不同组之间比较发现，复合发酵剂对发酵羊肉干的风味影响较小，天然乳清却可促进蛋白质、脂质分解，产生风味相关前体物质，提高肉干中特征风味物质含量[11]。

表2 不同发酵剂对发酵羊肉干中风味组成的影响Table 2 Effects of different starter cultures on flavor composition in fermented mutton jerky

醇类化合物的风味主要由肌肉中的共轭亚油酸被脂肪氧合酶和氢过氧化酶降解产生[27]，其阈值高于醛，故其对风味的贡献可能小于醛。对风味贡献较大的醇类主要是1-辛烯-3-醇、1-戊烯-3-醇和苯甲醇。1-辛烯-3-醇和1-戊烯-3-醇又称为蘑菇醇，其阈值较低，具有蘑菇香味，主要来源于花生四烯酸和亚油酸的脂质氧化[28-29]，如表2所示，1-辛烯-3-醇只在对照组和乳清+发酵剂组中检出，其中乳清+发酵剂组含量显著高于对照组（P＜0.05）；苯甲醇是重要芳香醇之一，常以酯类形式呈现并存在于玫瑰花油及肉制品中[13]。特征香味醇类物质主要源自原料肉，故成品中含量可能偏低或消失[11]。一般直链伯醇风味相对较弱，然而随着碳链增长，其风味也增强，表现为青香、木香和脂肪香特征；正丁醇在对照组中未检出，且乳清组的正丁醇含量显著高于其它2 组（P＜0.05）。而且有部分醇类可能是在微生物的参与下形成，部分醇类（如1-辛烯-3-醇、沉香醇）是添加亚硝酸盐后产生的风味物质[26]；各组沉香醇的含量依次为对照组>发酵剂组>乳清+发酵剂>乳清组，这与成品中亚硝酸盐的含量有关。

酮类化合物由氨基酸Strecker 降解、脂肪酸氧化热降解及微生物分解代谢产生，其风味独特，阈值低，大多具有奶油香或水果香味，随着碳链增加，风味愈加浓郁，对肉品风味有积极作用[30-31]。饱和酮是动物特征味和植物油脂味的来源，比如3-羟基-2-丁酮、2，3-丁二酮和戊二酮具有强烈的奶油香味；3-羟基-2-丁酮由肉制品中柠檬酸代谢产生二乙酸转化而来[32]。发酵剂组的3-羟基-2-丁酮含量显著高于其它3 组，而乳清组的3-羟基-2-丁酮含量显著低于其它3 组，说明成熟过程中乳清可能会抑制代谢柠檬酸生成二乙酸最终转化为3-羟基-2-丁酮，而单一复合发酵剂组有助于代谢柠檬酸生成二乙酸最终转化为3-羟基-2-丁酮，与王德宝等[11]研究结果一致。据研究表明，亚硝酸盐对酮类风味物质的影响并不明显[33]。

短链脂肪酸中的直链羧酸主要来自不饱和脂肪酸的水解，带有支链的羧酸大多由相应的醛衍生而成[20]。短链脂肪酸在羊肉中的含量较低，然而被认为对羊肉特征风味（膻味）的影响较大[33]。试验中共检测出5 种酸类物质（丙酸、乙酸、异丁酸、丁酸和异戊酸），其中对照组只检测出丁酸和异戊酸；发酵剂组未检出异戊酸；乳清组和乳清+发酵剂组均检测出5 种酸类物质。说明丙酸、乙酸、异丁酸是加入发酵剂才会生成的风味物质。乙酸主要是赋予发酵肉制品酸醋味，丁酸赋予发酵肉制品奶香风味[11]。表2所示，乳清+发酵剂组的乙酸含量显著高于其它组（P＜0.05）；而复合发酵剂组的丁酸含量显著高于其它组，对照组则显著低于其它组（P＜0.05）。

烃类物质是由脂肪酸的烷氧基均裂形成，具有较高阈值，被认为对肉品风味的直接作用较小，然而对整体风味有修饰作用[34]，试验中仅检出十甲基环五硅氧烷、八甲基环四硅氧烷、间异丙基甲苯和邻异丙基甲苯，对发酵羊肉干的整体风味影响较小。

发酵羊肉干中还检测出2，3，5，6-四甲基吡嗪、2，6-二甲基吡嗪、茴香脑、异丙基乙烯基醚、萜品烯和β-蒎烯3；其中吡嗪具有坚果味、烘烤味、青香、泥土香、类似土豆香等，其可以由不同的途径生成，如还原糖和氨基酸反应，美拉德反应中Amadori 重排化合物的热降解，α-氨基酸的热降解，或α-二羰基化物和醛这2 种物质与氨的反应，是肉加热过程中糖和氨基酸美拉德反应的典型产物[26]。如表2所示，对照组中并未检测出2，3，5，6-四甲基吡嗪和β-蒎烯3；复合发酵剂组的茴香脑和萜品烯的含量均显著高于其它3 组 （P＜0.05），乳清组的茴香脑和萜品烯的含量均显著低于其它3 组（P＜0.05）；乳清组同时检测出了2，3，5，6-四甲基吡嗪和2，6-二甲基吡嗪，而其它3 组都只检测出其中1 种。

3 结论

探究了天然乳清与复合发酵剂（木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌、戊糖片球菌和植物乳杆菌的比例为1∶1∶2∶1） 对发酵羊肉干盐硝酸盐和亚硝胺残留量以及风味物质形成的影响。试验组的亚硝酸盐、亚硝胺含量显著低于对照组，说明发酵剂有助于降低亚硝酸盐、亚硝胺在羊肉干中的残留量，其中乳清组显著低于其它3 组（P＜0.05），使其低于国家食品安全规定的肉制品中亚硝酸盐最高残留标准（30 mg/kg），提高了肉干的安全性。由于蛋白质和脂质的氧化分解使得发酵羊肉干具有了独特的风味，天然乳清组可提高发酵羊肉干中风味物质的种类，然而复合发酵剂组和乳清+发酵剂组可提高发酵羊肉干中风味物质的相对含量；亚硝酸盐的存在会产生部分醇类（如1-辛烯-3-醇、沉香醇），然而其会抑制醛类物质的产生，对酮类及其它物质影响较小。总之，乳清可提高肉干的风味感官品质和安全性。