昆明市手足口病病原构成及柯萨奇病毒A 组6 型基因特征分析（2016—2018 年）

李楠 姜黎黎 寸建萍 周晓芳 曹亿会 杨溪 田炳均

云南省疾病预防控制中心急性传染病防制所，昆明650022

手足口病是一种由多种肠道病毒（EV）引起的，主要累及儿童特别是5 岁以下婴幼儿。 它虽是一种自限性疾病，但是重症患儿可出现脑干脑炎等中枢神经系统并发症，严重的可致死亡[1]。 肠道病毒71型（EV-A71）和柯萨奇病毒A16 型（CV-A16）被认为是手足口病的主要病原[2]。 自2012 年开始出现相关报道后CV-A6 已经逐渐成为中国大陆手足口病传播的重要病原，近几年在一些地区CV-A6 已经取代EV-71 和CV-A16 成为手足口病暴发流行的主要病原[3]。 本研究探讨了2016—2018 年昆明市手足口病病原构成情况， 并对分离到的57 株CV-A6 毒株进行遗传进化分析以阐明昆明市流行的CV-A6 基因特征。

对象与方法

一、 研究对象

本研究中的病例信息来源于中国疾病预防控制信息系统——传染病报告信息管理系统。 收集2016—2018 年从云南省手足口病实验室监测系统采集到的2 935 份昆明市手足口病患儿的样本，大部分为粪便样本，少部分为咽拭子和肛拭子。 采集样本前告知采样对象或监护人员采样目的并发放知情同意书并签字。

二、仪器和试剂

仪器包括美国ABI 公司PCR 仪Veriti 96 Well Termal Cycler， 美国Bio-Rad 公司实时荧光定量PCR 仪CFX96。试剂包括美国Promega 公司Access Quick 试剂盒 （批号：A1250）， 德国QIAGEN 公司QIAamp Viral RNA Mini Kit（批号：1020953），江苏硕世生物科技公司CV-A16 型和EV-A71 型+EV 通用型核酸检测试剂盒（批号：20191001）。

三、研究方法

参照《手足口病实验室手册（第4 版）》[4]对收集到的患儿样本进行处理后，接种于人类横纹肌肉瘤（RD）细胞和人喉癌上皮（Hep-2）细胞（细胞来自中国CDC 病毒病预防控制所脊髓灰质炎实验室）进行病毒分离培养。 分离到的毒株使用德国QIAGEN 公司的病毒RNA 提取试剂盒提取病毒核酸， 以提取的病毒RNA 为模板， 用CV-A16 型和EV-A71 型+EV 通用型核酸检测试剂盒 （江苏硕世生物科技公司）进行实时荧光RT-PCR 检测，并对非EV-A71 和非CV-A16 阳性样本进行普通RT-PCR 扩增得到VP1 全长序列，对CV-A6 病毒进行基因进化分析。

四、病毒分型鉴定

以非EV-A71 和非CV-A16 的阳性样本提取的病毒RNA 为模板，使用美国Promega 公司的Access Quick RT-PCR 试剂盒和A、B 和C 组肠道病毒特异性引物[5]，对毒株VP1 区基因进行分段扩增、拼接和组装，得到CV-A6 全长VP1 编码区。 扩增条件：50 ℃30 min，95 ℃15 min；94 ℃30 s，45℃30 s，68 ℃50 s，40 个循环；68 ℃延伸10 min。 PCR 产物由上海生工生物技术有限公司（上海）双向测序。 测序结果在GenBank 中进行Blast 搜索初步定型，使用MEGA5.2 软件分析，依据Oberste 等[6]的理论判定病毒型别。

五、CV-A6 序列分析

从GenBank 下载文献[7-8]中所用的来自法国、日本、美国、芬兰、中国台湾及中国大陆的山东、上海、河南、广东、云南、浙江和吉林等12 个省（市）具有代表性的32 条CV-A6 VP1 区全长序列。 用MEGA 5.2 的临位连接法（NJ）和Kimura-2 参数法构建系统进化树，通过可靠性Bootstrap=1 000 进行评估。 以核苷酸平均差异＞15%划分基因型别[8-10]。

六、统计学分析

用Excel 录入和导出相关数据进行分析， 采用描述性流行病学方法分析手足口病流行特征及病原构成变化。

结 果

一、昆明市手足口病流行概况

2016 年昆明市报告手足口病20 197 例， 发病率302.49/10 万；2017 年昆明市报告14 357 例，发病率213.39/10 万；2018 年昆明市报告23 884 例，发病率352.12/10 万。 昆明市手足口病连续3 年病例数及发病率居云南省前5 位，并呈隔年高发的特点。 每年6 月均为发病高峰，此后发病水平逐渐下降，第二个流行高峰出现在12 月（见图1）。

图1 2016—2018 年昆明市手足口病按月发病情况

二、手足口病病原分布

2016—2018 年云南省手足口病实验室监测系统中共采集到的昆明市手足口病患儿样本2 935份， 实验室诊断阳性2 318 份， 阳性率78.98%。2016、2017 和2018 年检出手足口病病原的阳性率分别为84.35%（776/920）、79.21%（785/991）和73.93%（757/1 024），病原构成中EV-A71 占比逐年减少，CV-A16 所占比例隔年增高。 除2016 年CVA16 为优势病原， 其余年份均为其他EV，3 年间分离到CV-A6 共计57 株。 详见表1。

表1 2016—2018 年昆明市手足口病病原分布[株（%）]

三、CV-A6 昆明株基因进化分析

57 株昆明市CV-A6 毒株的VP1 区全长序列与32 条参考序列构建系统进化树见图2。 结果表明，2016—2017 年昆明市57 株CV-A6 与D3a 流行株亲缘性最近。昆明市CV-A6 毒株分为2 个进化分支（cluster），分支2 包含1 株昆明市2017 年的CV-A6和浙江、吉林、法国等地的6 条CV-A6 序列，cluster1则包含其余56 株昆明市CV-A6 和昆明市2014、2015 年以及中国大陆不同省份和中国台湾的8 条代表株。

57 株昆明市CV-A6 毒株序列之间核苷酸一致性为91.69%～100.00%， 氨基酸同源性为96.39%～100.00%， 它们与原型株核苷酸一致性为82.53%～83.61%，氨基酸同源性为94.10%～96.39%。 cluster 1与cluster 2 的核苷酸差异率为7.01%， 氨基酸差异率为2.63%。

讨 论

本次研究发现，自2017 年起其他EV 已经取代EV-A71 和CV-A16 成为优势病原。EV-A71 自2017年起占比的明显下降可能与EV-A71 型手足口病疫苗于2016 年问世有关。 其他EV 占比的升高可能与EV-A71 或者CV-A16 已在人群中建立了免疫屏障，从而使其他EV 成为手足口病主要病原有关[11]。 自2013年起，我国相继出现了CV-A6 相关手足口病暴发流行的报道[12]。 随后在我国的许多省份也报道了CVA6 取代EV-A71 和CV-A16 成为优势病原[13]，但在部分省份，如云南、四川和黑龙江的CV-A6 流行水平还很低[14]。 目前昆明市手足口病的流行中，CV-A6占比虽然不大，但已呈逐年上升趋势，提示可能存在CV-A6 相关手足口病暴发流行的潜在风险。

VP1 蛋白因其基因型与病毒血清型的完全对应，一直是肠道病毒基因分型和遗传进化研究的重点[15]。 我国多地基于CV-A6 VP1 全长序列进化分析的研究报道显示：早期CV-A6 的流行主要是D3 和D2 亚型的单独流行和共同流行，近几年一些地区出现D3 亚型完全取代D2 亚型形成单独流行[16]。 从基因进化树中可以看到2013 年昆明市尚有D2 亚型毒株（KY424358）的流行， 2014 和2015 年已经出现CV-A6 D3a 亚 型 毒 株（LC412013、KY424357）的 流行。 本次研究中分离到的57 株CV-A6，均为D3a 亚型，与国内多个省市地区一致[16-17]，表明CV-A6 D3a亚型近年来在昆明市的持续流行。

基于VP1 区基因进化分析发现， 昆明市的57条CV-A6 分为2 个进化分支，除1 条2017 年的序列在cluster2 外，其余56 条以及2014 和2015 年的昆明市代表株均分布在cluste1， 表明cluster1 是2016—2018 年昆明市CV-A6 流行的优势分支，而cluster1 又进一步分成了不同的簇， 提示昆明市CV-A6 存在基因多态性， 而随着基因多态性的增加， 可能引发未来昆明市CV-A6 相关手足口病流行规模的增大。 在目前其他EV 已成为昆明市手足口病优势病原的背景下，在今后常规监测工作中需加强对其他EV 的监测，同时也有必要对CV-A6 的流行及其基因特征进行持续监测和研究。

利益冲突 所有作者均声明没有利益冲突

图2 基于VP1 区构建的2016—2018 年昆明市CV-A6 系统进化树