CpG1826 对重组新型冠状病毒亚单位疫苗的协同免疫增强效果研究

杨宏宏 沈钱通 李思奇 安彤 于鹏程 张月 徐凯 陈彦霖 陈刚 高孟 庄昉成

1 杭州医学院基础医学与法医学院310053； 2 中国疾病预防控制中心病毒病研究所， 北京102206； 3 浙江普康生物技术股份有限公司，杭州310053

新型冠状病毒（SARS-CoV-2）在全球范围内广泛传播，该病毒致病性强可引起重症肺炎并导致死亡，是当前严重的公共卫生问题[1-2]，而接种疫苗是目前针对新型冠状病毒防控的主要措施之一。 在候选疫苗中， 重组亚单位疫苗因其具有安全性高、生产成本低等优势而受到广大研究者关注，但该类疫苗需要佐剂增强免疫原性[3]。传统铝佐剂作为世界范围内应用最广泛的人用疫苗佐剂[4]，已经在抗HPV和HBV 疫苗中发挥重要作用[5-6]。 铝佐剂通过延缓抗原释放和降低抗原降解并刺激天然免疫细胞来发挥佐剂作用[7-8]，然而铝佐剂更偏向诱导Th2型免疫应答，而对诱导Th1 类免疫应答的能力较弱[9]。为了克服铝佐剂疫苗的缺陷，考虑开发联合佐剂以提高疫苗的免疫效力。CpG ODN 是一种含非甲基化的寡聚脱氧核苷酸基序，能够通过激活DC 或巨噬细胞的Toll 样受体，提高亚单位疫苗的Th1 应答[10-12]。根据CpG 基序的不同，已有多种CpG 被证明具有很好的免疫佐剂作用，如1826 和1018 等。 本研究旨在以CpG1826作为协同佐剂，评价其与铝佐剂对大肠埃希菌表达的SARS-CoV-2 亚单位疫苗的协同免疫增强效果。

材料与方法

一、材料

原核表达载体pET28a 和大肠埃希菌BL21（DE3）感受态细胞由浙江省医学生物工程疫苗研究开发重点实验室保存；质粒提取、胶回收等常规分子生物学实验试剂盒以及辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG、HRP 标记的羊抗鼠IgG 购自北京康维世纪生物科技有限公司； 蛋白Marker 购自上海雅酶生物科技有限公司；CpG1826 由北京擎科生物技术有限公司合成（5'-TCCATGACGTTCCTGA CGTT-3'，全硫代修饰）；铝佐剂（氢氧化铝）购自丹麦的Croda 公司；SARS-CoV-2 的S 蛋白兔单克隆抗体购自北京义翘神州生物技术有限公司； 竞争性ELISA 检测中和抗体试剂盒购自南京金斯瑞生物科技有限公司； 小鼠IFN-γ 酶联免疫斑点试验（ELISPOT）试剂盒购自北京达科为生物技术有限公司；SARS-CoV-2 的S 蛋白多肽库由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；Vero-E6 细胞和SARS-CoV-2毒种由中国CDC 病毒病研究所保存；清洁级BALB/c小鼠（试验动物合格证号：20170005023355），4～8 周龄，所有动物在浙江中医药大学实验动物中心饲养和实验[SYXK（浙）2018-0012]。

二、大肠埃希菌表达的sRBD 亚单位抗原的制备

根据 GenBank SARS-CoV-2 的基因序列（MN908947.3），选取其刺突蛋白上的受体结合区（RBD）基因，按照大肠埃希菌密码子偏好进行优化，委托北京擎科生物进行人工基因合成，所得合成基因在N 端引入组氨酸标签后插入pET28a表达质粒， 得到重组表达载体pET28a-HIS-RBD，经热激法转入大肠埃希菌BL21（DE3）感受态细胞得到重组表达菌株。 所得重组表达菌株经IPTG诱导表达后，离心收集菌体，在冰浴下超声破碎菌体，提取包涵体沉淀。 所得包涵体沉淀用尿素溶液变性重悬溶解后， 经Ni-NTA 纯化系统纯化， 用透析液进行透析、 过滤除菌， 即为所需SARS-CoV-2 RBD（sRBD）重组抗原。

三、sRBD 亚单位抗原的免疫印迹鉴定

将纯化的重组sRBD 蛋白经SDS-PAGE 分离后，通过电转印法转移至硝酸纤维素膜上，脱脂奶粉封闭后加入SARS-CoV-2 的S 蛋白兔单克隆抗体（1∶1 000），37 ℃孵育1 h 后洗膜3 次， 加入HRP标记羊抗兔抗体 （1∶1 000），37 ℃孵育30 min 后洗膜3 次，最后加ECL 显色、拍照。

四、动物小鼠免疫

将BALB/c 小鼠随机分成3 组， 铝佐剂疫苗组（sRBD 蛋白20 μg/只，氢氧化铝佐剂250 μg/只）、CpG+铝佐剂疫苗组（sRBD 蛋白20 μg/只，CpG1826 10 μg/只，氢氧化铝佐剂250 μg/只）、空白 对照组（CpG1826 10 μg/只， 氢氧化铝佐剂250 μg/只），每组18 只小鼠，雌雄对半。 具体免疫程序为间隔1周腹腔免疫，共免疫3 针。 在首针免疫7、14 和28 d后，每组分别取免疫小鼠6 只（雌雄对半），取血分离血清，同时处死取脾淋巴细胞。

五、间接ELISA 法测定小鼠血清结合抗体效价

用包被液稀释至终浓度1 μg/mL 的sRBD 蛋白包被96 孔板，4 ℃包被过夜。洗板后用含有1%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐吐温缓冲液封闭。 将血清用含1% BSA 的磷酸缓冲盐溶液（PBS）按梯度3 倍稀释，每个稀释度血样作3 个复孔加至96 孔板中，同时以稀释液作为阴性对照。 37 ℃孵育1 h，洗板3次后加入HRP 标记的羊抗鼠IgG 酶标抗体（1∶30 000），37 ℃孵育30 min，洗板3 次后加TMB 显色液显色。用酶标仪测定各孔OD450值， 以阴性对照OD450均值的2.1 倍为cut-off 值， 以OD450均值高于cut-off 值的最大稀释倍数作为血清结合抗体效价。

六、竞争性ELISA 法测定小鼠血清结合抗体水平

所得小鼠血清稀释150 倍后， 参照竞争性ELISA 中和抗体检测试剂盒说明书， 与等体积HRP偶联的SARS-CoV-2 RBD 蛋白混合，37 ℃孵育30 min。随后将混合液加入预包被ACE-2 蛋白的96孔板，每个小鼠血清设置2 个复孔，37 ℃孵育15 min，同时以稀释液作为阴性对照。 酶标仪于450 nm 处测定各孔OD 值。 小鼠血清结合抗体水平通过血清抗体对RBD 蛋白与ACE-2 细胞受体蛋白之间结合能力的竞争性抑制来实现， 具体计算方法如下：血清中和抗体=（1-样品孔OD 均值/阴性对照孔OD均值）×100%。

七、活病毒血清中和抗体的测定

小鼠血清用含DMEM 培养基作连续倍比稀释[1 ∶（4 ～256）]， 分 别 与SARS-CoV-2 病 毒 液（2×103CCID50/mL）按体积比1∶1 混匀，37 ℃孵育1 h。所得病毒抗体混合液分别接种于长满单层Vero-E6细胞的96 孔板中，每个血清稀释度设置2 个复孔，同时设置病毒原液阳性对照孔及DMEM 培养液的阴性对照孔，用显微镜观察各孔细胞病变情况。 抗体效价以能中和相应病毒而阻止细胞病变的血清最高稀释度计算。

八、免疫小鼠特异性IFN-γ 检测

对小鼠实施颈椎脱臼，无菌条件下取脾脏制备淋巴细胞悬液并稀释至5×106个细胞/mL。将制备的淋巴细胞悬液接种于96 孔细胞培养板中，每孔100 μL，用SARS-CoV-2 RBD 多肽作为刺激物，按ELISPOT试剂盒说明书检测小鼠脾淋巴细胞中特异性分泌IFN-γ 的效应T 细胞数。

九、统计学分析

采用GraphPad Prism 8.2.1 软件处理相关数据，符合正态分布的计量资料采用x±s 表示，组间差异用单因素方差分析， 组间两两比较采用SNK 法进行统计学分析，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

结 果

一、 重组蛋白sRBD 的表达、纯化与鉴定

所得重组菌经IPTG 诱导在相对分子质量为28 000 处有一条特异性条带，相对分子质量大小与理论值相符（图1），免疫印迹结果显示该特异性条带能被SARS-CoV-2 的S 蛋白兔单克隆抗体特异性识别（图2）。

图1 SARS-CoV-2 重组蛋白RBD 在大肠埃希菌中表达的SDS-PAGE 分析

图2 SARS-CoV-2 重组蛋白RBD 的Western 印迹法分析

二、 CpG1826 对免疫小鼠血清结合抗体效价的影响

1.采用间接ELISA 检测免疫小鼠血清结合抗体效价

表1 可见，首针免疫7、14 和28 d 后，3 组小鼠特异性血清IgG 水平的差异均有统计学意义 （F=7.643、10.010 和21.440，P 均<0.01）。在首针免疫14 d后（即二针免疫7 d 后），铝佐剂疫苗组和CpG+铝佐剂疫苗组的特异性结合抗体水平均高于对照组（t=3.877 和5.534， P 均<0.01）， 但是铝佐剂疫苗组和CpG+铝佐剂疫苗组之间的结合抗体水平差异没有统计学意义（t=1.583， P>0.05）。 在首针免疫28 d 后（即三针免疫14 d 后），CpG+铝佐剂疫苗组的特异性结合抗体水平高于铝佐剂疫苗组 （t=2.892，P<0.05）。

表1 免疫后小鼠特异性血清IgG 水平检测

2.竞争性ELISA 法测定小鼠血清结合抗体水平结果

如表2 所示，在首针免疫7、14 和28 d 后，三组间 差 异 均 有 统 计 学 意 义 （F=15.790、19.920 和159.400，P 均<0.01）；其中首针免疫7 d 后，铝佐剂疫苗组和对照组均未产生结合抗体， 而CpG+铝佐剂疫苗组已产生结合抗体，与铝佐剂疫苗组存在显著差异（t=4.185，P<0.01）；首针免疫14 d 后（即二针免疫7 d 后）， 铝佐剂疫苗组和CpG+铝佐剂疫苗组的结合抗体水平均高于对照组 （t=6.823 和5.251，P 均<0.01），且CpG+铝佐剂疫苗组的结合抗体水平高于铝佐剂疫苗组（t=3.267，P<0.01）；首针免疫28 d 后 （即三针免疫14 d 后）， 铝佐剂疫苗组和CpG+铝佐剂疫苗组的结合抗体水平均随时间推移而提升，且两者差异有统计学意义（t=2.441，P<0.05）。

表2 免疫后小鼠血清结合抗体抑制率的测定

三、CpG1826 对免疫小鼠血清中和抗体水平的影响

对首针免疫28 d 后（即三针免疫14 d 后）的小鼠血清进行活病毒中和试验，结果显示，3 组间差异有统计学意义（F=8.470， P<0.01）；与对照组相比，铝佐剂疫苗组和CpG+铝佐剂疫苗组的小鼠活病毒血清中和抗体几何平均滴度 （GMT） 分别为8.00±5.06 和65.33±51.70，均能诱导小鼠产生明显的中和抗体（t=3.873 和3.095， P 均<0.05），且CpG+铝佐剂疫苗组的中和抗体水平高于铝佐剂疫苗组 （t=2.703，P<0.05）。

四、CpG1826 对免疫小鼠特异性IFN-γ 水平的影响

通过ELISPOT 检测免疫后小鼠脾淋巴细胞特异性IFN-γ 分泌水平， 结果如图3 所示， 首针免疫7、14 和28 d 后（即首针免疫7 d 后、二针免疫7 d后、三针免疫14 d 后），三组间效应T 细胞数均存在显著差异（F=25.360、36.990、660.400，P 均<0.01），3次检测中CpG+铝佐剂疫苗的小鼠脾淋巴细胞产生的特异性IFN-γ 效应T 细胞数分别为179.68±69.26、395.58±139.64、563.50±43.79，均高于铝佐剂疫苗组（t=3.969、5.292 和22.310，P 均<0.01）。 随着免疫次数的增加， 相较于铝佐剂疫苗组，CpG+铝佐剂疫苗组小鼠脾淋巴细胞产生特异性IFN-γ 的效应T细胞数上升更快，增加更加显著。

图3 ELISPOT 检测免疫小鼠特异性IFN-γ 水平

讨 论

CpG ODN 作为一种良好的疫苗佐剂，其在体内被Toll 样受体9（TLR9）识别后，通过一系列信号级联放大反应，直接或间接刺激各种免疫细胞分泌细胞因子，促进Th1 型为主的免疫应答，调节体液和细胞免疫水平[12-13]。 Dou 等[14]发现CpG ODN 作为佐剂与禽白血病病毒抗原gp85 配伍后免疫实验动物后， 相比弗氏佐剂，CpG ODN 能够显著提高其血清中禽白血病抗体水平， 为CpG ODN 的体液免疫效应提供了科学依据；Fu 等[15]认为不同序列的CpG ODN 作为佐剂能够有效提高灭活的H5N1 型禽流感病毒疫苗的细胞免疫应答， 可显著提高IL-6、IL-12 和TNF-α 等Th1 型细胞因子相对表达量，为CpG ODN 增强细胞免疫应答提供了理论基础。目前已有CpG1018 作为佐剂成功应用于上市的乙型肝炎疫苗， 这为CpG ODN 的临床安全性奠定了良好的基础[16]。

本研究表明， 将SARS-CoV-2 亚单位疫苗与自行设计的对免疫细胞有刺激作用的CpG1826、铝佐剂配伍后免疫小鼠，小鼠血清的IgG 水平、结合抗体水平、中和抗体水平均显著高于单用铝佐剂的疫苗组，且其小鼠血清的结合抗体水平上升早于单用铝佐剂的疫苗组，说明CpG1826 作为协同佐剂，其与铝佐剂对大肠埃希菌表达的sRBD 亚单位抗原的协同免疫增强作用， 可以加速机体对抗原的免疫应答，缩短sRBD 蛋白结合抗体的产生时间，有效提高机体的中和抗体水平。 同时，CpG1826 特有的免疫刺激途径，能在短时间内（首针免疫7 d 后）激活机体产生高水平的Th1 型细胞免疫应答，显著提升机体产生针对sRBD 的特异性IFN-γ 的效应T 细胞水平。Th1 途径免疫应答的激活，能增强机体的细胞免疫反应，能刺激产生特异性的细胞毒性T 淋巴细胞杀伤反应，这对清除宿主体内已感染病毒的细胞很有意义。

综上所述，增强免疫刺激、平衡Th1/Th2 型免疫应答的CpG1826 可以弥补单纯应用铝佐剂的不足。 CpG1826 有望成为一种SARS-CoV-2 亚单位疫苗的候选佐剂，提升疫苗的免疫增强效果，提高机体的抗感染保护作用， 然而CpG1826 作为SARSCoV-2 亚单位疫苗佐剂真正应用于临床还有很长的路要走， 包括符合药用辅料级别的CpG1826 的制备、安全性评价等，都需要进一步研究和完善。 此外，CpG1826 作为佐剂所产生的疫苗抗体持久性也应该是研究关注的焦点，对此我们正进一步探索。

利益冲突 本文利益各方就知识产权分配已达成一致，无利益冲突