双硫仑联合Cu抑制胃癌细胞作用的研究

逄琳，陈新，王艳，吕秀娟

(沈阳市第四人民医院干诊科，辽宁 沈阳 110000)

0 引言

中国是胃癌大国，每年新发病例以及胃癌相关死亡事件分别占到世界总数的47%和48%。我国胃癌成为第二大常见癌症及第三大死因[1,2]。目前胃癌的治疗效果较差，晚期胃癌中位生存时间仍未突破16个月，仍需进一步探索新的治疗手段。目前进行新型癌症药物的开发非常昂贵且耗时，随着现代医学技术的发展，包括基因组学、蛋白组学、代谢组学等研究给胃癌的病因探索和诊疗策略的研究带来了突飞猛进的变化[3,4]。新技术的发展为胃癌药物临床带来了新的机遇，分子靶向药物的研究如火如荼，新靶点药物层出不穷。进入靶向时代二十年来，胃癌患者生存期的延长、生活质量的提高，进步很大，但仍然很有限，有效的靶向药物还很少。如何加快抗胃癌药物的研发速度，迎接挑战，克服新药研发的困境是近期的努力方向。用于治疗其它疾病的药物进行重新定位或许有望用于治疗胃癌。双硫仑就是一种便宜、安全且具有悠久历史的戒酒药物，国内外已有多篇论文证实了双硫仑药物在乳腺癌、肺癌、淋巴瘤等恶性肿瘤中的抗癌作用。最近有研究发现双硫仑的细胞毒性依赖于铜(Cu)[5,6]。由于它是一种二价金属螯合剂，所以研究认为双硫仑与Cu形成一种更容易被细胞吸收的复合物。双硫仑及其代谢产物均可诱导氧化应激，而氧化应激已被证实可以调节自噬和凋亡[7,8]。自噬和凋亡之间有着亲密的相互作用，他们拥有相似的效应器和调节因子。有望通过本项研究将进一步探讨其在胃癌肿瘤细胞中的抗癌活性及其机制。

双硫仑在临床中一直被用作一线戒酒药物，没有严重的副作用，近期有研究发现，患有肿瘤的患者中同时服用双硫仑药物戒酒的患者生存期明显优于未服用者。本研究主要探索其抗肿瘤的机制。

1 对象与方法

1.1 研究对象

研究选取沈阳市第四人民医院2018年～2019年就诊的确诊胃癌患者，并留取胃癌细胞，体外培养胃癌细胞，用分别不同浓度的双硫仑与Cu对胃癌细胞进行作用，采用MTT法检查胃癌细胞的细胞活力与细胞增殖率，确定各自最佳剂量与效应的关系。

1.2 研究方法及观察指标

观察双硫仑联合Cu对胃癌细胞增殖与移行的作用；观察双硫仑联合Cu对胃癌细胞凋亡与自噬的作用；探讨自噬与凋亡在胃癌细胞增殖过程中的相互影响与作用。研究中采用免疫荧光结合单克隆抗体方法对胃癌细胞进行鉴定。使用相应最佳浓度作用于胃癌细胞后，进行凋亡与自噬相关指标检测：流式细胞仪通过Annexin-V和PI双染色检测Casepas-3、Casepas-8的变化，同时用Western-blot和Realtime-PCR检测凋亡与自噬相关蛋白等(Caspase -3、Caspase-8、LC3B)的表达。用免疫荧光法对胃癌相关自噬小体进行定位于半定量分析(LC3B)。

1.3 统计分析

研究使用SPSS 19.0统计软件包分析研究数据，多组数据之间差别比较使用F检验(计量资料)以及卡方检验(计数资料以及等级资料)；研究的检验水准均使用P＜0.05为差别有统计学意义。

2 结果

2.1 双硫仑联合Cu作用后胃癌细胞细胞活性与增殖率

IC50拟合曲线结果胃癌细胞24h的IC50为0.340μmol/L。采用CCK-8法检测联合用药对细胞增殖抑制的剂量依赖性。药物浓度为1，2，3和5μmol/L的抑制率分别为(80.45±0.88)%， (82.98±0.97)%，(81.35±0.95)%和(86.12±0.74)%；可见观察组抑制作用较对照组明显增强。详见表1所示。

表1 观察组与对照组抑制率分布情况(%)

2.2 双硫仑联合Cu作用后胃癌细胞的细胞凋亡率变化

观察组可见流式细胞仪检测在胃癌细胞中，药物浓度为0，1，3和5μmol/L的凋亡率分别为(7.04±0.50)%，(9.03±0.48)%，(13.18±0.65)%和(14.42±0.19)%。药物诱导24 h后细胞出现胞体变圆、缩小和脱落。

2.3 观察组及对照组Casepas-3Casepas-8蛋白表达分布情况

本次研究结果还提示，观察组Casepas-3 Casepas-8蛋白表达分别为(8.98±1.09)mL/mg和(3.09±1.31)mL/mg；对照组Casepas-3 Casepas-8蛋白表达分别为(13.22±1.43)mL/mg和(16.05±1.55)mL/mg；Casepas-3蛋白表达在观察组显著更低，而Casepas-8蛋白表达则可见在观察组显著更高。详见表3所示。

表2 观察组剂对照组凋亡率分布情况(%)

表3 两组Casepas-3 Casepas-8蛋白表达分布情况(mL/mg)

2.4 观察组及对照组自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ表达分布情况

本次研究结果还提示，Western blot检测观察组胃癌细胞自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ表达，可见在药物0.5、1、2、和4umol/L浓度下，相对表达量分别为(74.90±0.64)、(82.09±0.52)、(90.37±0.62)和(110.64±0.59)；此外对照组胃癌细胞该蛋白表达相对表达量为(30.24±0.59)，如表4所示。

表4 观察组及对照组自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ表达分布情况

3 讨论

双硫仑(disulfiram，DSF)为常见的戒酒药，1948年Jacobsen等发现人体吸收少量双硫仑可引起面部潮红、头痛、腹痛、出汗、呼吸困难等症状，饮酒后这些症状会更加明显，摄入DSF后的饮酒症状称也因此被称为双硫仑样反应[9]。双硫仑作为二价过渡金属离子螯合剂，近年来研究发现，其在多种肿瘤中发挥抑制肿瘤功效；当DSF 联合二价铜离子、锌离子、铬离子等金属离子时，抑制肿瘤效果更为显著，但其抑制肿瘤生长机制具有种属及细胞特异性[5,10]。DSF价格低廉、同时细胞毒性低及良好的抗肿瘤效果等优势，有望作为抗肿瘤药物应用于临床。但其也有不足之处，比如DSF水溶性差，在体内存在稳定性欠佳，等等。

流行病学数据提示，胃癌高发与发展中国家及经济发展水平较差的地区[11]；双硫仑作为一种经典药物，价格相对低廉，如果能证实其可以在体外杀伤胃癌细胞则为今后其应用于临床提供了理论基础，从而减轻政府及患者的经济负担[9,10]。本次研究即围绕双硫仑与Cu的各自最佳剂量与协同剂量，同时确定药物作用时间与给药时间点等展开分析讨论，力争完成药物配伍，同时对药物作用后的胃癌细胞进行增殖、迁移相关实验，对细胞形态进行光镜与电镜观察，对自噬与凋亡相关蛋白表达与基因表达指标进行检测，就机理进行深入分析。本次研究结果提示，IC50拟合曲线结果胃癌细胞24h的IC50为0.340μmol/L。采用CCK-8法检测联合用药对细胞增殖抑制的剂量依赖性。药物浓度为1，2，3 和5μmol/L的抑制率分别为(80.45±0.88)%，(82.98±0.97)%，(81.35±0.95)% 和(86.12±0.74)%；可见观察组抑制作用较对照组明显增强。观察组可见流式细胞仪检测在胃癌细胞中，药物浓度为0，1，3和5μmol/L的凋亡率分别为(7.04±0.50)%，(9.03±0.48)%，(13.18±0.65)%和(14.42±0.19)%。药物诱导24h后细胞出现胞体变圆、缩小和脱落。充分提示Cu双硫仑联合作用可以充分抑制胃癌细胞并诱导其发生凋亡。

本次研究结果还提示，观察组Casepas-3 Casepas-8蛋白表达分别为(8.98±1.09)mL/mg和(3.09±1.31)mL/mg；对照组 Casepas-3 Casepas-8蛋白表达分别为(13.22±1.43)mL/mg和 (16.05±1.55)mL/mg；Casepas-3蛋白表达在观察组显著更低，而Casepas-8蛋白表达则可见在观察组显著更高。Western blot检测观察组胃癌细胞自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ表达，可见在药物0.5、1、2、和4umol/L浓度下，相 对表达量分 别为 (74.90±0.64)、(82.09±0.52)、(90.37±0.62)和(110.64±0.59)；此 外对照组胃癌细胞该蛋白表达相对表达量为(30.24±0.59)。可见Cu双硫仑的促进胃癌细胞凋亡达到抑制肿瘤目的的潜在机理与下调Casepas-3蛋白表达以及上调Casepas-8蛋白表达，并进而上调自噬相关蛋白(比如LC3B-Ⅱ)存在关联，是可能的作用机制。

本研究的主要内容为探索药物的抗肿瘤机制，故以社会效益为主，旨在探索新的治疗方式，为胃癌患者带来福音。研究结果充分提示Cu双硫仑联合作用可以充分抑制胃癌细胞并诱导其发生凋亡；主要机理与Cu双硫仑的促进胃癌细胞凋亡达到抑制肿瘤目的的潜在机理与下调Casepas-3蛋白表达以及上调Casepas-8蛋白表达，并进而上调自噬相关蛋白(比如LC3B-Ⅱ)存在关联。另外，本次研究创新点与特色还表现在胃癌现有的治疗手段以手术为主，由于胃镜检查在我国体检中并不作为常规检查项目，因此很多患者首次发现时已失去手术机会。对于中晚期胃癌以化疗及靶向治疗为主。已经批准用于胃癌治疗的靶向药物仅有曲妥珠单抗、阿帕替尼及Ramuciremab.在全球范围内胃癌的药物临床研究很多但成功的寥寥无几，多种因素限制了胃癌新药的临床研发。本项目的创新点在于老药新用，可以大大节省研发新药的费用。