复合微生物菌剂对玉米秸秆的预处理与厌氧产气性能的研究

李靖，董良杰，崔彦如，赵叶明，赵胜楠，高海，何自涵

(1 吉林农业大学工程技术学院，吉林 长春 130118；2 吉林省农业科学院，吉林 长春 130124；3 南充市农业科学院，四川 南充 637000)

秸秆是世界上最为丰富的物质之一,是粮食作物和经济作物生产中的副产物，其中含有丰富的氮、磷、钾、微量元素等成分。我国年产农作物秸秆7亿多吨，约占世界年秸秆产量的30%[1]，其中玉米秸秆2.5亿吨，东北地区年玉米产量1亿吨以上，年产秸秆达1.1吨左右，占全国玉米秸秆资源的40%～50%。玉米秸秆含有丰富的碳水化合物、矿物质及粗蛋白等营养成分，玉米秸秆中60%以上的碳水化合物、2%～4%的蛋白质、0.5%～1%的脂肪，纤维素、半纤维素与木质素约占38%、24%、18%，是一种可供开发与综合利用的资源之一[2]。全国至少仍有1/3的秸秆没有被合理的利用，我国大多采用直接燃烧的方式进行处理，由此带来环境污染、火灾事故、土壤矿化等一系列问题。

吉林省作为我国重要的粮食生产基地，玉米是主要的农业作物，据2015年统计，吉林省玉米秸秆年产量4 000万吨，其中肥料化还田占40%～55%，12%～15%用于饲料化(部分畜牧养殖区比例上浮)，8%～12%用于燃料化(包括农村冬季取暖)，1%～3%用于基料化，仍有近30%以上没有实现资源化利用，大量的玉米秸秆直接焚烧，一方面造成资源浪费，另一方面也造成大量的区域污染[3]。玉米秸秆成分结构致密，其所含的纤维素、半纤维与木质素更是难以被微生物降解，在自然条件下降解玉米秸秆则需要很长一段时间[4]，要在厌氧发酵前进行预处理工作，根据目前研究现状分析，利用微生物预处理玉米秸秆水解玉米秸秆中的有机物质已成为一种有效的解决办法。微生物预处理技术是利用外加的具有生物活性的酶，利用单一的菌株或复合的菌群在前期预处理中加快玉米秸秆的分解，利用微生物预处理技术后不仅能降低耗能、避免二次污染，还可以在后续厌氧发酵过程中产生一定的促进作用，而且对于纤维素、半纤维素与木质素也可起到一定的降解作用[5]。

本文将采用乳酸菌、EM菌剂、黑曲霉、白腐菌、草酸青霉及木霉，共计6中微生物菌剂复合用于玉米秸秆的前期预处理试验中，通过试验以期达到玉米秸秆的高效水解与高效的厌氧发酵产气的技术，为农业废弃物的资源化、能源化利用提供新的解决措施。

1 材料与方法

1.1 试验材料

玉米秸秆：取自吉林省农科院玉米试验田，经过田间自然晒干，后经过揉搓曝气处理，使粒径为0.7～1 cm。玉米秸秆预处理微生物：来自市面上出售的乳酸菌、EM菌、黑曲霉、白腐菌、草酸青霉及木霉经过微生物培养后接种使用。牛粪：取自吉林省农科院畜牧分院养殖场。试验原料与接种物基本性质如表1所示。

表1 试验原料与接种物基本性质

1.2 试验装置与仪器

1.2.1 试验装置

本试验主要可分为微生物预处理试验与厌氧发酵产气试验两部分，且两部分均独立完成。微生物预处理试验是将培养后的乳酸菌、EM菌、黑曲霉、白腐菌、草酸青霉及木霉与揉搓曝气处理后的玉米秸秆按比例混合后室温下25 ℃条件下进行储存。厌氧发酵产气阶段将采用自制厌氧发酵产气系统，如图1所示，使其在35 ℃、TS为15%的条件下进行中温发酵。

图1 厌氧发酵产气试验装置

1.2.2 试验仪器设备

岛津分析天平AUY系列 AUY220电子分析天平(日本岛津有限公司)、DHP-9402电热恒温培养箱(上海华零实业有限公司)、FEI Quanta FEG 650 扫描电子显微镜(赛默飞材料与结构分析电镜事业部)、TGL-16G 高速冷冻离心机(金坛市精达仪器制造有限公司)、HH-8 数显恒温水浴锅(金坛市精达仪器制造有限公司)、101系列 数显鼓风干燥箱(北京东信力搏科技有限公司)、i7 紫外可见光光度计(济南海能仪器股份有限公司)、DZS-708型 多参数分析仪(上海仪电科学仪器股份有限公司)、HW-1340 超净工作台(东莞市弘维净化科技有限公司)、YXQ-LS-75SII 立式蒸汽压力灭菌器(北京中科浩宇科技发展有限公司)、GC-2014C气相色谱(日本岛津有限公司)。

1.3 试验方法与设计

1.3.1 菌剂的预处理

(1)培养基。PDA培养基：称取39 g固体培养基粉末溶于1 L水中，121 ℃灭菌15 min。

(2)菌种培养。孢子悬浮液的制备：将以上菌种活化后移至PDA平板上，于30 ℃培养4～6 d，至长满孢子时用用无菌水冲洗至三角瓶中，加入灭菌玻璃珠，在200 r·min-1的振荡器中震荡30 min，取出，利用血球计数板计数[6]，调整至每种菌种的孢子数在106mL-1。

复合微生物菌剂CM-2：将以上菌种的孢子悬浮液按照体积比为1∶1∶1∶1∶1∶1的比例混合。

复合微生物预处理玉米秸秆：每1 kg上述揉搓曝气处理后的玉米秸秆接种80 mL上述制备好的复合微生物菌剂，室温25 ℃储存。空白对照组则采用揉搓曝气处理后的玉米秸秆，其他不做任何处理，室温25 ℃。

1.3.2 试验设计

经过复合微生物菌剂预处理后的玉米秸秆保存30 d，每天设置2个重复共3组平行试验，空白对照试验组选取经过上述揉搓曝气处理后的同一批玉米秸秆并且不添加任何微生物菌剂与其它处理的条件下重复上述过程。室温下保存，每天取样，共计30天，分别对其pH、还原糖、纤维素、半纤维素与木质素进行测定。

厌氧发酵产气阶段是将每天处理后的玉米秸秆与新鲜牛粪，按照干物质比为1∶2，TS为15%，发酵温度为35 ℃，加入经过充分发酵后的沼液调节至有效体积至0.8 L，进行35 d中温批次厌氧发酵试验。空白对照组的厌氧发酵产气原料取自上述预处理试验中的空白对照组的玉米秸秆重复上述处理步骤。每组试验设置3组平行试验，每隔2 d测定其产气量与气体成分。

1.4 分析方法

TS、VS 测定参照重量测定方法。利用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法[7]与紫外分光光度计测定预处理后的玉米秸秆的还原糖；使用多参数分析仪测定不同预处理时间后的玉米秸秆的pH 值[8]；纤维素、半纤维素、木质素采用洗涤滴定法[9]。采用排水集气法收集气体，每隔2天定时测量厌氧反应器中排出的水量，即为沼气的产气量(mL)，同时利用气相色谱仪对产气进行分析。

2 结果与分析

2.1 复合微生物菌剂预处理

2.1.1 复合微生物菌剂预处理玉米秸秆不同时间对pH变化的影响

经过复合微生物菌剂CM-2以及空白对照组的预处理后的玉米秸秆测定其在不同处理天数时的pH值，如图2所示，经过复合微生物菌剂CM-2处理的玉米秸秆其pH变化基本呈现先迅速下降后趋于稳定的状态，而空白对照组的玉米秸秆其pH值基本保持稳定。经过复合微生物菌剂CM-2处理后的玉米秸秆其pH从开始的6.8下降至后期的3.9，说明经过复合微生物菌剂CM-2处理后的玉米秸秆在预处理期间进行了部分水解，有乙酸等挥发性酸的产生，第3天～第21天，pH下降速率快，说明在此过程中有酸性物质的积累，至第21天～第29天时，能被复合微生物菌剂CM-2消耗的有机质成分以基本消耗完毕，同时水解产生的酸类物质也为后续的厌氧发酵提供了物质基础。

图2 玉米秸秆pH变化图

2.1.2 复合微生物菌剂预处理玉米秸秆对纤维素、半纤维素与木质素含量的影响

纤维素主要是由葡萄糖分子通过1,4-β糖苷键链接聚合而成的高分子化合物，水解多产生葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶、β-葡萄糖苷酶[10]，在生产过程中属于较易被处理部分；半纤维素则是由除了葡萄糖以外还有木糖、半乳糖、甘露糖等成分构成[6]，其中以木糖的水解较为复杂，需要经过两次或两次以上的水解才可将大分子糖类转化为小分子的葡萄糖等物质，属于较难被降解有机物质；而木质素结构较为复杂，一般则认为木质素主要苯丙烷单元通过醚键和C-C键连接而成的聚酚类三维网状高分子芳香族化合物，难以被降解处理[11]。本次试验使玉米秸秆在经过复合微生物菌剂CM-2预处理后其纤维素降解率达到52.94%，半纤维素降解率达33.33%，而难以被降解的木质素其降解率也可达到2.67%(图3)，这说明经过复合微生物菌剂CM-2处理后的玉米秸秆产生了能够促进纤维素、半纤维素与木质素水解的酶，在将大分子有机物水解的同时，也保障了后期厌氧发酵的产气效率。

图3 复合微生物菌剂预处理玉米秸秆纤维素、半纤维素与木质素含量的变化

2.2 复合微生物菌剂预处理玉米秸秆对厌氧发酵产气的影响

2.2.1 产气量的影响

由于空白对照组在厌氧产气发酵试验阶段发酵原料能够正常维持厌氧发酵所需的有机物质，且有合适的碳氮比与发酵温度，故而能使空白对照组正常产气并且可作为经过复合微生物菌剂CM-2处理组的产气对照组。本次试验设定发酵周期为35 d，经过复合微生物菌剂CM-2预处理后的玉米秸秆其产气能力与未经处理的空白对照组之间的产气能力有很大的差异，通过测定其开始产气时间、进入产气高峰时间和维持产气高峰期的时间发现经过复合微生物菌剂CM-2预处理后的玉米秸秆在第1 d已经开始有产气，较空白对照组提前了2 d，此外，经过微生物处理组在第13 d开始进入产气高峰期，且维持时间长，进入产气高峰天数达14 d；相比而言，空白对照组则是在第17 d开始进入产气高峰且维持时间短，仅维持6 d(图4)。这一现象则说明，经过复合微生物菌剂CM-2处理后的玉米秸秆对提前产气与增长产气高峰时间上都有良好的促进作用，进而提高玉米秸秆能源化的转化。

图4 厌氧发酵日产气量

2.2.2 累积产气量的影响

两组试验在经过35 d厌氧产气发酵后的累积产气量如图5所示。

图5 厌氧发酵累积产气量

经过35 d的厌氧发酵，微生物预处理后的玉米秸秆的累积产气量可达7 170 mL，而空白对照组的累积产气量则为5 006 mL，两组试验累积产气量的差异极显著(P<0.01)，综合比较，经过复合微生物菌剂CM-2处理后的玉米秸秆在经过厌氧产气发酵后的累积产气量要比空白对照组的高30.18%，效果明显，说明复合微生物菌剂CM-2预处理玉米秸秆对厌氧发酵的高效运行有明显的促进作用。

2.2.3 甲烷含量的影响

本次的两组试验在每次测定产气量的同时，测定其甲烷的体积分数，经过35 d 的厌氧产气发酵，两组试验的甲烷体积分数的变化如图6所示，经过复合微生物菌剂CM-2处理后的玉米秸秆在厌氧产气第11 d时，其甲烷体积分数为37.765 4%，已经接近40%，并且甲烷体积分数超过40%的天数能够维持到第29 d，且甲烷体积分数最高还可达到77.096 43%，这说明在此段反应时间有足够的厌氧反应所需的有机物质来供给厌氧发酵，维持厌氧反应过程的高效运行，相比来看，空白对照组则在反应开始后的第15 d时，甲烷的体积分数才达到40%以上，并且甲烷体积分数维持在40%以上的天数仅有10 d，经过两组试验对比来看，可以说明经过复合微生物菌剂CM-2处理后的玉米秸秆在厌氧发酵过程中对于甲烷的转化率高。

图6 厌氧发酵甲烷含量

3 讨论

我国秸秆资源丰富，其中玉米秸秆中含有丰富的有机物质，其主要由碳水化合物、蛋白质、脂肪，纤维素、半纤维素与木质素约组成[2]，但由于纤维素、半纤维素和木质素难以被直接的水解，若不经过预处理直接进行厌氧发酵处理其有机物质应用效率较低，故而将采取预处理措施，增加纤维素、半纤维素与木质素的水解，进而对后续厌氧发酵起到促进作用[12]。

1)揉搓曝气预处理与微生物预处理相结合可有效破坏纤维素、半纤维素与木质素，加快水解。常娟等[13]对玉米秸秆采用蒸汽爆破的方法，然后再进行单一米曲霉的预处理试验中，将进过蒸汽爆破处理后的玉米秸秆与米曲霉混合预处理6 d后，其纤维素与半纤维素的降解率可达27.89%和64.80%，而只进行爆破处理的玉米秸秆其纤维素的降解率只有8.47%。而高赞等[14]利用黑曲霉、绿色木霉等混合后的复合菌对玉米秸秆进行预处理研究试验中，经过15 d的预处理周期，玉米秸秆中的纤维素、半纤维素的降解率可达48.53%、36.38%。本文研究采用将玉米秸秆揉搓曝气预处理与复合微生物菌剂CM-2相结合，经过30 d预处理周期，与直接经过揉搓曝气预处理后的玉米秸秆相比，纤维素半纤维素的降解率可达52.94%和33.33%，并且木质素的降解率也有2.67%。由此可知，经过揉搓曝气与复合微生物菌剂CM-2预处理后的玉米秸秆可以有效提高玉米秸秆中纤维素与半纤维素的水解。

2)玉米秸秆中的有机物质在经过预处理后能够更好的在厌氧发酵过程中被应用，黄文博等[15]利用白腐菌对玉米秸秆进行前期预处理以提高沼气产气量研究中，经过白腐菌处理后的玉米秸秆在厌氧发酵试验中的累积产气量较未经白腐菌处理的空白对照组提高了12.32%；赵肖玲等[16]利用黑曲霉与木霉复合菌剂处理秸秆提高产甲烷性能研究中发现，经过微生物处理后的玉米秸秆在进行厌氧发酵时其累积产气量较未经微生物处理的对照组提高了10.06%；黄开明[17]等人利用黑曲霉、木霉、草酸青霉和白腐菌对玉米秸秆进行前期预处理以提高产气性能研究中，经过复合微生物预处理后的玉米秸秆其累积产气量比未经复合微生物预处理的对照组提高了27.4%，并且在第4 d时，甲烷含量达到40%以上。本文试验表明，在经过复合微生物菌剂CM-2处理后的玉米秸秆在厌氧产气发酵试验中累积产气量有明显提升，经过35 d的厌氧发酵，累积产气量提高了30.18%。因此经过复合微生物菌剂处理后的玉米秸秆在水解纤维素半纤维素与木质素的同时，在适当的厌氧发酵环境中可以获得较高的甲烷产气量，从而提高玉米秸秆资源的利用。

4 结论

本次试验利用复合微生物菌剂CM-2预处理玉米秸秆，可使玉米秸秆的纤维素降解52.94%、半纤维素降解33.33%、木质素降解2.67%，对经过复合微生物菌剂CM-2预处理后的玉米秸秆与牛粪按照1∶2的比例，在35 ℃条件下进行35 d的厌氧产气发酵其累积产气量提高30.18%，并且采用复合微生物菌剂CM-2处理后的玉米秸秆其产气效率有明显的增加并且产气高峰期时间可延长至14 d且在产气高峰时的甲烷转化率也提高了12.87%。

综上所述，利用复合微生物菌剂CM-2处理玉米秸秆在降解纤维素、半纤维素与木质素的同时，实现了在中低温条件下，厌氧产气效率的提高，增加了玉米秸秆中的有机物质转化为甲烷的能力，为秸秆资源能源化的推进提供了良好的解决方法。此外，本次研究所采用的厌氧发酵浓度可达15%，属于干法发酵，此种方式更适于应用在北方寒冷地区，对北方寒冷地区沼气工程的推进起到一定的促进作用，并且还为玉米秸秆在预处理方式上提供了新的高效处理方法。