新疆策勒县喜马拉雅旱獭无形体和埃立克体病原的筛查与鉴定

董巧燕，桑春丽，王宝菊，颜彬，王远志，吾热力哈孜·哈孜汗*

(1 石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832003;2 石河子大学医学院，新疆 石河子 832003;3 华中科技大学同济医学院附属协和医院，湖北 武汉 430022;4 山东枣庄医院，山东 枣庄 277100)

喜马拉雅旱獭(Marmota Himalayana)属啮齿目(Rodentia)松鼠科(Sciuridae)旱獭属(Marmota)的大型的地栖型啮齿动物，其典型形态特点为自鼻端经两眼眉间到两耳前方之间有一个近似于三角形的黑色毛区，称为“黑三角”。喜马拉雅早獭是陆生和穴居的草食性、冬眠性野生动物。主要栖息于海拔2500-5200 m的高山草甸草原、高山草原山地环境。广泛分布于我国青藏高原地带以及印度、尼泊尔、锡金、克什米尔等地，为青藏高原最常见也是体形最大的啮齿动物。作为生态系统中的重要一员，喜马拉雅旱獭对人类及环境的生存和发展产生巨大的影响。近年来应用该动物建立人类疾病动物模型的研究不断深入[1]，开展野生旱獭的实验动物化研究意义重大。

无形体科包括4个属，分别是无形体属(Anaplasma)、埃及小体属(Aegyptianella)、血巴通氏体属(Heamobartonella)和附红细胞体属(Eperythrozoon)。嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum)属于立克次体目(Rickettsiales)、无形体科(Anaplasmataceae)、无形体属(Anaplasma)，是一种专性细胞内寄生的革兰氏阴性菌，主要寄生在粒细胞中，引起反刍动物蜱咬热、马边虫病以及人粒细胞无形体病。该病原体在欧洲、亚洲及美国分部广泛，能够感染多种哺乳动物的粒细胞，而且不同来源的病原体遗传变异较大，其生物学特性也具有很高的多样性[2]。

埃立克体属隶属于立克次体目。自1935年从犬体内获得第1株埃立克体以来，迄今发现11种埃立克体。目前对埃立克体的分类主要采用细菌分类鉴别的“金指标”，即16 S rRNA基因序列分析法。根据其同源性，可将埃立克体分为3个基因群，分别为犬埃立克体群、嗜吞噬细胞埃立克体群和腺热埃立克体群[3]。

喜马拉雅旱獭为冬眠动物，因此季节对其生理生化指标有一定的影响，但目前系统对旱獭生物学特性研究的报道较少，本团队与华中科技大学同济医学院联合建立了乙肝动物模型-喜马拉雅野生旱獭的驯化基地，并养殖喜马拉雅旱獭近两年，通过定期观察体重、饮食、活动，对其生理习性进行记录，定期采集血样检测血常规、血生化指标，建立了一整套喜马拉雅旱獭病原(包括体内细菌、寄生虫、病毒、蜱传病原、蚤传病原)分子检测系统，本研究针对蜱传病原埃立克体和无形体对旱獭进行分子检测研究，目的是通过对策勒县捕获的旱獭进行无形体和埃立克体分子检测，为喜马拉雅旱獭作为乙肝实验动物模型的病原净化奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

在办理《新疆维吾尔自治区狩猎证》的基础上，在2018年8-9月份在新疆和田地区的策勒县海拔为2500-5200 m的山区捕获喜马拉雅旱獭52只，采集旱獭血液、肝、脾、心、肺、肾、小肠、大肠等样本，并登记标本的背景资料(包括：时间、地点、性别、年龄及体重等)，快速置于-80 ℃超低温冰箱保存。DNA提取试剂盒TIANamp Genomic DNA Kit(DP060530)购自天根生化科技有限公司；PCR所用试剂均购自大连宝生物工程有限公司；DNA Marker购自北京天根生化科技有限公司；琼脂糖购自Sigma公司。

1.2 旱獭的鉴定

首先对旱獭的体型、外貌进行形态学鉴定，然后根据已知旱獭线粒体Cytb基因序列在NCBI网站中进行查找，分析验证参考文献[4-5]中的引物，委托上海祥音生物工程技术服务有限公司合成基因引物，引物序列上游为′ATGACAAACACCCGCAAAAYCCA'，下游为′CTTCATTTAAGRAGTTTGTTT'。PCR反应体系10×PCR buffer 2.5 μL，三磷酸脱氧核糖核苷 dNTP(10 mmol)2.5 μL，上游引物(20 μmol·L-1)1.5 μL，下游引物(20 μM)1.5 μL，模板DNA(约50 ng·μL-1)2 μL，Taq DNA聚合酶1 μL，ddH2O 14 μL，总体积25 μL。PCR 反应条件：预变性95 ℃，5min；变性95 ℃，60 s,退火48 ℃，60 s,延伸72 ℃，2min，反应35个循环；72 ℃延伸5 min。对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，120伏电泳30 min，放置在凝胶成像仪中拍照分析。然后使用天根生物公司的TIANgel Midi Purification Kit(目录号：DP209-03)，参照试剂盒说明书操作步骤回收DNA。将目的DNA片段连接在pGM-T载体上，具体操作步骤参照天根生物公司pGM-T克隆试剂盒(目录号：VT202-02)说明书[6]。将PCR扩增阳性的产物送往北京华大基因公司测序。测序结果在BLAST工具进行检索，比对GenBank中已上传的核酸序列的相似性，并上传相关基因序列到NCBI网站。

1.3 旱獭的病原检测

对进行分子生物学鉴定的旱獭内脏组织样本置于无菌的EP管中。使用天根生化科技有限公司的TIANamp Genomic DNA Kit(目录号：DP060530)，参照试剂盒说明书操作步骤提取旱獭组织基因组DNA，-20 ℃保存备用。采用巢式PCR扩增无形体16S rDNA[7]和嗜吞噬细胞无形体基因MSP4[8]，埃立克体使用引物16S rDNA[7]，引物委托上海祥音生物工程技术服务有限公司合成基因引物。16S rDNA外围引物序列上游为′TTGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACG'，下游为′CAC CTCTACACTAGGAATTCCGCTATC'，内围引物序列上游为′GTAATACTGTATAATCCCTG'，下游为′GTA CCGTCATTATCTTCCCTA'。内外围反应条件：预变性94 ℃，5 min；变性92 ℃，30 s,退火55 ℃，30 s,延伸72 ℃,30 s,反应35个循环；延伸72 ℃，8min。MSP4外围引物序列上游为′ATGACTTACAGAGAATTGCTTGTAGG'，下游为′TTAATTGAAAGCAAATCTTGCTCCTA'。反应条件：预变性94 ℃，5 min；变性94 ℃，30 s，退火63 ℃，30 s，延伸72 ℃，70 s，反应37个循环；72 ℃延伸6 min。MSP4内围引物序列上游为′CCTATCTGCGGCCGCAGTAT'，下游为′TTGAAGCCGTAACTAGCTATATTTGC'。反应条件：预变性94 ℃，5 min；变性94 ℃，30 s；退火60 ℃，30 s，延伸72 ℃，70 s，反应37个循环；72 ℃延伸6 min。对PCR目的产物进行测序分析，并上传相关基因序列到NCBI网站。

1.4 遗传进化分析

对测序获得的旱獭序列、无形体和埃立克体序列均进行遗传进化分析。用自展检验(bootstrap test)方法估计系统树中各个节点的置信值，绘图重复参数设置为1 000次，用Maga7.0软件基于最大相似法(Maximum Likelihood)建立遗传发育进化树。

2 结果

2.1 旱獭线粒体基因PCR扩增与Cytb测序鉴定(图1)

M：MarkerⅢ；1：阴性对照；2：阳性对照；3-6：旱獭组织核酸。

基于Cytb引物PCR扩增喜马拉雅旱獭线粒体基因片段，在目的片段出现1140 bp大小条带(图1)，符合预期片段长度。经比对分析结果显示，本研究获得的旱獭序列与青藏高原东北部的喜马拉雅旱獭(登录号：MF115786)同源性最高，与GenBank中已有的獭种相应序列的相似性分别达到98.07%～99.35%。

2.2 无形体和埃立克体的检测

2.2.1 无形体和埃立克体的PCR检测结果

基于16S rDNA基因巢式PCR扩增无形体和埃立克体，基于MSP4基因巢式PCR扩增嗜吞噬细胞无形体，分别得到653 bp(图2)和849 bp(图3)，符合预期片段大小。52份喜马拉雅旱獭中，PCR检出4只旱獭组织器官无形体阳性，1只则为埃立克体阳性，个体阳性率分别为7.69%(4/52)和1.92%(1/52)。此外，不同组织的检测情况有所不同，无形体中以心脏检出率最高，为7.69%(4/52)；肝脏的检出率次之，为3.85%(2/52)，在脾脏、肺脏，肾脏和小肠中PCR均检出1份，阳性率为1.92%(1/52)。埃立克体中分别从肝脏，肺脏和小肠中检出，阳性率为1.92%(1/52)(表1)。

M：MarkerⅡ；5：阴性对照；6：阳性对照；1：heart(Anaplasma)；2：spleen(Anaplasma)；3：liver(Ehrlichia)；4：lung(Ehrlichia)。

M：MarkerⅢ；4：阴性对照；5：阳性对照；1-3：旱獭心脏组织核酸。

表1 无形体和埃立克体在喜马拉雅旱獭内脏组织中检测结果

2.2.2 无形体的测序与遗传进化分析结果

PCR产物经测序分析发现，捕获于新疆和田地区策勒县高海拔山区的野生喜马拉雅旱獭，在其内脏组织中检出无形体的基因型为嗜吞噬细胞无形体(A.phagocytophilum)，BLAST分析其与马鹿(Cervus elaphus)、棕熊(bear)、野猪(wild boar)和人等来源的病原对应序列(登录号分别为：MF974855、KM205430、KF747337、KF747336和KF747339)，其同源性为100%。

16S rDNA的遗传进化树分析显示：喜马拉雅旱獭来源的嗜吞噬细胞无形体序列与这些物种来源的序列聚为一支，与野马(Equus caballus)和狗(dog)(登录号为：EU839859和KP861634)形成姊妹支(图4)。

图4 基于无形体16SrDNA基因构建的遗传进化树

2.2.3 埃立克体的测序与遗传进化分析结果

BLAST和16S rDNA 遗传进化树分析显示：本研究获得的埃立克体序列与亚洲璃眼蜱来源的Ehrlichia sp.(KJ410254)序列具有100%的同源性，在遗传进化树中聚为一支，与中国Uncultured Ehrlichia sp.(JX402603)形成姊妹支(图5)。

图5 基于埃立克体16SrDNA基因构建的遗传进化树

3 讨论

喜马拉雅旱獭又名哈拉、雪猪，目前对于喜马拉雅旱獭的研究仅集中在个别物种以及个别病原(如鼠疫耶尔森菌、布鲁氏菌、喜马拉雅旱獭肝病毒等)的检测上[9-11]，并没有引起人们足够的认识。嗜吞噬细胞无形体是一种专性的细胞内寄生虫，是一种人畜共患病蜱传立克次病原体，主要以哺乳动物的粒细胞为目标，定位于细胞质中膜结合的空泡中，导致人、马、狗等宿主粒细胞无形体病，以发热伴白细胞、血小板减少和多器官功能损害为主要临床表现，该病在北美洲、欧洲和亚洲广泛传播[12]。在欧洲，曾在狍、马鹿、野猪和河堤田鼠(Myodes glareolus)中发现噬吞噬细胞无形体的感染[13-14]。RAR等[15]在俄罗斯鄂木斯克省棕背鼠平(Myodes rufocanus)和河堤田鼠中检测到嗜吞噬细胞无形体核酸。BATTISTI等[16]在意大利特伦托省的红狸(Vulpes vulpes)、欧洲獾(Meles meles)和郊狼(Canis lupus)中检测到嗜吞噬细胞无形体核酸。在中国，ZHAN等[17]在绵羊、山羊和褐家鼠中也检测到嗜吞噬细胞无形体核酸。本研究首次在喜马拉雅旱獭脏器和组织中检测到嗜吞噬细胞无形体核酸，关于其病原分离、对旱獭的致病性还有待进一步研究。

埃立克体是一种专性细胞内革兰氏阴性细菌，可引起人、啮齿动物、反刍动物和狗致病[18]，主要表现为发热、寒战、白细胞和血小板减少、血清氨基转移酶活性升高，伴有轻度到中度的肝损伤。2010年，NICHOLSON等[19]在美国宾夕法尼亚州的研究证明北美旱獭(Marmota monax)中有查菲埃立克体(Ehrlichia chaffeensis)。2003年，CHAE等[20]在韩国军事训练基地的黑线姬鼠(Apodemus agrarius)、西伯利亚鼠(Mustela sibirica)和托奈斯特鼠(Cricetulus triton nestor)的脾脏中检测到犬埃立克体(Ehrlichia canis)、伊氏埃立克体(Ehrlichia ewingii)嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum)和扁平无形体(Anaplasma platys)核酸，并表明黑线姬鼠是多种无形体和埃立克体主要的感染宿主。在本研究中，我们从喜马拉雅旱獭肝、肺、小肠中检出未定名种埃立克体(Ehrlichia sp.)核酸，BLAST分析显示，该埃立克体与亚洲璃眼蜱的Ehrlichia sp.(KJ410254)序列的同源性为100%。考虑到埃立克体为蜱传病原，未来应加强喜马拉雅旱獭体表寄生蜱埃立克次体等蜱传病原的筛查。

蜱传病原包括细菌、寄生虫和病毒等。喜马拉雅旱獭是蜱传病原感染的自然宿主，同时也是乙肝病毒感染的模式实验动物。未来针对喜马拉雅旱獭进行蜱传病原的全面解析，对于喜马拉雅旱獭虫媒传染病的系统认识、模式实验动物的优化具有重要意义。