氮素形态对不同茬次紫花苜蓿氮素积累及利用的影响

刘文涛，王玉强，孙盛楠，赵 仪，沈 宇，钱 进，严学兵

（1. 扬州大学动物科学与技术学院，江苏 扬州 225009；2. 教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室，江苏 扬州 225009）

紫花苜蓿(Medicago sativa)是广泛栽培利用的豆科牧草，关于紫花苜蓿的生产中是否需要施氮以及施氮对其的影响一直存在争议。以往大量研究表明，适量施氮可以提高紫花苜蓿产量和地上地下累积生长量[1-3]，提高紫花苜蓿氮代谢关键酶活性并增加其氮素积累量[4]。也有研究指出，施氮对紫花苜蓿生长和生物量没有显著影响[5-6]，甚至是无益的[7]。有学者分析造成这种分歧的原因主要有研究地点不同(土壤、水分、温度等条件不同)、研究方法不同(盆栽试验、大田试验)、研究年限不同(月动态、年动态)等[8]。实际上，肥料种类和氮素形态也是造成紫花苜蓿对氮素添加有不同响应的原因。在施氮的研究中，常用的氮肥有尿素[3,9-11]、硝酸钙、硫酸铵[4,12]、硝酸铵、硝酸钠、氯化铵[13]等。使用不同种类、浓度及不同配比的氮肥会对植物的生长产生不同甚至相反的影响。

氮素形态是影响植物生长发育的重要因素，它通过调控植物的光合作用与呼吸作用，以及根系吸收矿质元素等过程，进而影响植物的生长和发育。我国是氮肥消费大国，在农业生产实践中，氮肥常包含两种形态：铵态氮和硝态氮，这是植物可以吸收和利用的主要无机氮形式[14]。研究者已发现氮素形态的重要性，并在大量对农作物和经济作物的施氮研究中区分不同氮素形态的作用。如对玉米(Zea mays)[15-16]、欧洲羽扇豆(Lupinus angustifolius)[16]、水稻(Oryza sativa)[17]、小麦(Triticum aestivum)[18]等的研究。一般来讲，旱地植物喜硝，水淹土种植的作物喜铵。有研究认为硝态氮能够促进植物光合碳同化和蔗糖的积累，对茎叶生长和调控叶片老化也有积极作用，而铵态氮能够促进植物叶片中淀粉的积累，提高植物的光合能力，但是铵态氮过多也会导致植物代谢失调，发生“铵中毒”[14,19-20]。Ashton 等[21]指出，不同植物物种喜好不同氮素形态，植物对不同形态氮素的吸收和利用具有可塑性。相较于众多关注氮素形态对作物生长影响的研究，仅有少数学者关注氮素形态对紫花苜蓿生长及氮素利用率等的影响[4,12]，限于紫花苜蓿品种、地区气候条件差异等因素，这方面的研究还有待完善。鉴于此，本研究以紫花苜蓿为试验材料，分析不同形态氮素对紫花苜蓿氮含量、氮素积累量以及氮素利用率的影响，旨在探索不同形态氮肥在紫花苜蓿生产中的应用，为人工种植紫花苜蓿合理施氮、提高其生产性能提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

紫花苜蓿(WL440HQ) 购于北京正道生态科技有限公司，秋眠级6 级。供试氮肥为硝酸钠(NaNO3，16% N)和氯化铵(NH4Cl，26% N)。

1.2 试验设计

本试验在扬州大学草学智能温室中进行，温室一楼为种植区，土壤为重壤土。选取1.5 m × 1.5 m质地相似的16 个小区，采用完全随机设计，设置4 个处理，分别为对照组 (N0，不施氮)、单施NaNO3组()、 单 施NH4Cl 组 () 以 及NaNO3和NH4Cl 1 ∶ 1 混施组(Nmix)，每个处理4 个重复。

1.3 试验方法

2019 年4 月底对试验小区进行翻耕、除杂等处理，测定土壤基础养分：有机质含量12.62 g·kg-1，全氮含量0.78 g·kg-1，铵态氮含量12.36 mg·kg-1，硝态氮含量8.38 mg·kg-1，速效磷含量35.42 mg·kg-1，速效钾含量72.5 mg·kg-1，pH 8.13。5 月初进行条播，行距15 cm，播种深度2 cm。施氮量按纯氮计200 kg·hm-2，分3 次，在播种期、第1 次刈割后、第2 次刈割后分别以液态施入。苗期每周利用温室自动喷淋装置进行人工降雨1 次。期间进行日常除杂，保持通风。种植当年于初花期刈割，共刈割3 次。每次刈割后取植物根际0 - 20 cm 土壤，去除细根等杂物，带回实验室进行分析。

1.4 测定指标

土壤有机质、速效磷、速效钾、全氮、铵态氮和硝态氮含量测定参照《土壤农化分析》[22]；植物株高即测自然状态下植株的自然高度；挖出植物完整根系，测定根系长度，以及地上和地下部分鲜重。植物根及叶片中硝态氮和铵态氮含量采用试剂盒测定(购于苏州科铭生物科技有限公司)。氮素积累量、氮素吸收效率(nitrogen uptake efficiency, NUPE)和氮肥利用率的计算方法如下[23]：

氮素积累量(kg·hm-2) = 干物质 × 含氮量；

氮素吸收效率 = 植株氮素积累量/施氮量 × 100%；

氮肥利用率 = (施氮处理植株地上部氮含量 -不施氮处理植株地上部含氮量)/施氮量 × 100%。

1.5 数据处理

利用Microsoft Excel 2010 对原始数据进行整理。采用SPSS 19.0 对数据进行分析，对不同形态氮素对紫花苜蓿生长特征、氮含量、氮素积累量、氮素吸收率、氮肥利用率和土壤理化指标的影响进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，Duncan 法进行多重比较，相关分析采用Pearson 系数。使用Sigma plot 14.0 作图。

2 结果与分析

2.1 不同形态氮素对不同茬次紫花苜蓿根际土壤化学性质的影响

图 1 不同形态氮素对不同茬次紫花苜蓿根际土壤化学性质的影响Figure 1 Effects of different nitrogen forms on soil chemical properties of alfalfa rhizosphere in different stubbles

添加不同形态氮素对不同茬次紫花苜蓿根际土壤有机质含量影响不显著(P ＞ 0.05)，随着刈割茬次增加，混合施氮下的土壤有机质含量逐渐降低，在第2 和3 茬时均低于对照组处理。在刈割前两茬时，各处理间土壤pH 没有显著变化(P ＞ 0.05)，在第3 茬时，单施硝态氮处理的pH 显著高于其他3 组的，单施铵态氮处理下的土壤pH 最低(P ＜ 0.05) (图1)。在第1 茬时，施氮处理下的土壤速效磷含量均显著高于对照组(P ＜ 0.05)，随刈割茬次增加，只有单施铵态氮处理组的土壤速效磷显著高于对照组，其余各处理组与对照组没有显著差异(图1)。说明单施硝态氮或混施氮可能促进紫花苜蓿对磷的吸收，因此该处理下的土壤速效磷含量低于单施铵态氮处理组。除了第3 茬的单施硝态氮组外，其余各处理的土壤速效钾含量在各个茬次都显著高于对照组(P ＜ 0.05)，在第2 茬时，各处理下的土壤速效钾含量最高，说明速效钾不是限制紫花苜蓿生长的主要因素。

2.2 不同形态氮素对不同茬次紫花苜蓿植株及根际土壤氮含量的影响

不同茬次，土壤全氮含量在施氮处理组都有增高，尤其在单施铵态氮和混施氮处理组都显著高于对照组(P ＜ 0.05) (图2)。各施氮处理组的土壤硝态氮含量也显著高于对照组，随刈割茬次增加，混合施氮处理组的土壤硝态氮含量最高。与土壤硝态氮含量的变化不同，土壤铵态氮含量在不同茬次不同处理下都没有显著的变化(P ＞ 0.05)，这可能是施入的铵态氮被迅速转化为硝态氮，因此土壤硝态氮含量存在明显波动，而铵态氮含量变化不显著。

在前两茬混合施氮处理下的紫花苜蓿植株全氮含量最高(P ＜ 0.05)，第3 茬时，单施硝态氮处理＞紫花苜蓿植株全氮含量显著高于其余各处理组，所有施氮处理下的植株氮含量均显著高于对照组(P ＜0.05) (图2)。各茬次各处理下的植株硝态氮、铵态氮含量都显著高于对照组。其中，植株硝态氮含量在各个茬次中都是混合氮处理组最高，而植株铵态氮含量在第1 茬时，尽管各处理组的含量都显著高于对照组(P ＜ 0.05)，但各处理间无显著差异(P ＞0.05)。

2.3 不同形态氮素对不同茬次紫花苜蓿氮素积累及利用的影响

图 2 不同形态氮素对不同茬次紫花苜蓿植株及根际土壤氮含量的影响Figure 2 Effects of different nitrogen forms on the nitrogen content of alfalfa rhizosphere soil in different stubbles

添加不同形态氮素在不同茬次都显著提高了植株地上生物量，在第2 茬时，混合施氮处理组植株地上生物量显著高于其余各处理组(P ＜ 0.05) (图3)。通过计算添加不同形态氮素后紫花苜蓿的氮素积累量、氮素吸收率和氮肥利用率，结果显示，第1 茬时，混合施氮下的氮素积累量、氮素吸收效率和氮肥利用率显著高于单施铵态氮处理组(P ＜ 0.05)，第2、3 茬时混合施氮和单施硝态氮处理组显著高于单施铵态氮处理组(图3)，地上生物量、氮素积累量、氮素吸收效率和氮肥利用效率都是在第2 茬时高于其他两茬。说明在刈割状态下，紫花苜蓿在刈割第2 茬产量最高且对不同形态氮肥，尤其是对硝态氮肥和混合氮肥的吸收和利用效果较好。

图 3 不同形态氮素对不同茬次紫花苜蓿氮素积累及利用的影响Figure 3 Effects of nitrogen forms on the nitrogen accumulation and use efficiency of alfalfa in different stubbles

图 4 不同茬次紫花苜蓿生物量和氮含量的主成分分析Figure 4 PCA of the biomass and nitrogen content of alfalfa in different stubbles

通过主成分分析对不同茬次紫花苜蓿地上生物量、氮含量进行聚类(图4)，沿第1 轴方向，添加不同形态氮素处理对紫花苜蓿的生长和氮素积累有明显的影响，各处理组明显区别于对照组，且单施硝态氮处理组和混施氮处理组的样点分布较集中，说明这两种处理对紫花苜蓿生长、氮素积累的影响相似，但是与单施铵态氮处理组不同。主成分分析第1 轴解释了不同茬次各处理间95.8%的紫花苜蓿生长和氮含量变化，第2 轴解释了3.7%的变化。

2.4 紫花苜蓿氮素积累与土壤因子的关系

相关分析结果表明(图5)，第1 茬时，紫花苜蓿氮素积累量与土壤速效磷、速效钾、硝态氮和全氮含量呈显著正相关关系(P ＜ 0.05)。第2 茬时，紫花苜蓿氮素积累量与土壤速效钾、硝态氮、全氮含量呈显著正相关关系，与土壤pH 呈显著负相关关系，说明土壤pH 升高会抑制紫花苜蓿对氮素的积累(P ＜ 0.05)。第3 茬时，紫花苜蓿氮素积累量仅与土壤硝态氮和全氮含量呈显著正相关关系(P ＜ 0.05)。说明随着刈割茬次的增加，紫花苜蓿对氮素的积累由依赖氮、磷、钾多营养元素的供应逐步转变为对土壤氮含量的依赖，尤其是土壤硝态氮和全氮含量。

图 5 不同茬次紫花苜蓿氮素积累量与土壤因子的关系Figure 5 Correlations between the nitrogen accumulation of alfalfa and soil chemical properties in different stubbles

3 讨论

3.1 不同形态氮素对不同茬次紫花苜蓿根际土壤化学性质的影响

施肥能显著改变土壤理化性质，土壤有机质、速效磷和速效钾含量能够表征土壤的养分水平，土壤全氮、硝态氮和铵态氮含量则反映了土壤的供氮能力[3,14,24]。Zia 等[25]在苏格兰斯凯岛进行的模拟不同形态氮沉降的试验中发现，添加不同比例的铵态氮和硝态氮对土壤可溶解有机碳没有显著影响，在∶ NO3-为9 ∶ 1 时添加生石灰能够显著增加土壤pH 和可溶解有机碳含量。与该研究结果相似，本研究中添加不同形态氮素并没有显著改变土壤有机质含量，其中铵态氮处理下的土壤有机质含量在数值上高于其他处理。在刈割第1 茬时，土壤速效磷含量在各处理组显著高于对照组，随着刈割茬次的增加，第2、3 茬土壤速效磷含量低于第1 茬，仅铵态氮处理高于其他处理组。这一方面是由于最初施基肥产生的正向效应，另一方面也说明土壤硝态氮可能促进植物对磷的吸收，从而使土壤速效磷的消耗增加，含量下降[11]。与土壤有机质、速效磷含量变化相比，土壤速效钾含量受处理影响较大，各施氮处理下的土壤速效钾含量显著高于对照组，且在混合态氮处理组达到最高。但是，李燕青等[26]的研究发现，单施尿素没有显著改变土壤速效钾含量，而单施猪粪、鸡粪和牛粪则显著增加了土壤速效钾的含量。由于土壤中钾的富集带来的负面影响较小，并能促进植物吸收利用氮素，因此本研究中混合态氮处理下土壤速效钾含量增加，也在一定程度上促进了紫花苜蓿对氮素的吸收和利用。土壤pH 只在第3 茬时发生了显著变化，并且在各处理下都保持在中性偏碱的水平，说明外源氮素对土壤酸碱度的影响需要一段时间才能显现出来。且添加铵态氮会促进H+的释放而显著降低土壤pH，添加硝态氮会因为大量释放OH-而提高土壤pH[27]。以往研究表明土壤保持无机氮的能力与土壤pH、氮素形态、环境条件密切相关。当土壤pH 呈中性或碱性时，硝化作用强，土壤中无机氮以NO3-为主，而铵态氮常由于发生氨挥发而损失[28]。本研究中采用人工降水，保持水分适中，且土壤为中性偏碱性，因此土壤中NO3-相对稳定，硝态氮成为土壤氮素的主导形态。添加不同形态氮素处理对土壤铵态氮含量影响不显著，这与王丹等[3]、王西娜等[29]的研究结果一致。除了添加的硝态氮源外，铵态氮的阳离子状态使得它容易被带负电荷的土壤胶体吸附固持，且易被硝化微生物转化为硝态氮[3,30]，因此土壤硝态氮含量显著提高。同时土壤全氮含量的增加也能提高矿化势，增加氮的矿化量，提高植物对氮素的吸收和利用效率。

3.2 不同形态氮素对不同茬次紫花苜蓿氮素积累及利用的影响

不同植物对不同形态氮素的响应不同。越来越多的证据表明，植物对氮素资源的适应具有可塑性[21]，为了适应有效氮供应水平的波动，不同的植物群落可能会将它们对有机氮的依赖转变为对铵态氮和硝态氮的依赖，这有助于它们适应自然界中氮素形态的变化[31-32]。本研究中添加不同形态氮素均能提高紫花苜蓿植株全氮、硝态氮及铵态氮含量，单施硝态氮和混合态氮处理组对提高植物氮含量和地上生物量的效果相似且具有明显优势，这也说明紫花苜蓿可能是一种“喜硝”植物[2]。如果外源施入的氮素形态与植物偏好的氮素形态相契合，植物就能更好地吸收和利用氮素[28]。在本研究中，土壤中的氮素形态以硝态氮为主导，而紫花苜蓿又偏好于硝态氮，因此在硝态氮处理下紫花苜蓿地上生物量更高。而由于较强的硝化作用将铵态氮转化为硝态氮，因此混合施氮处理的效果要比单施硝、铵态氮肥效果好。于铁峰等[33]的研究也发现，当∶为5 ∶ 3 时，紫花苜蓿的粗蛋白含量、蛋白总量、可消化干物质都显著提高，综合营养品质最佳。本研究中，无论是地上生物量、氮素积累量、氮素吸收效率和氮肥利用率，都在第2 茬时达到高峰，且施混合态氮处理表现最佳，这与叶芳等[12]的研究结果一致。刘晓静等[4]的研究还发现在刈割第2 茬时，紫花苜蓿中的硝酸还原酶活性高于其他茬次，这在紫花苜蓿对氮肥的吸收利用中起到关键作用。此外，对于豆科植物，氮素形态也影响其生物固氮过程。以往研究结果发现在紫花苜蓿营养生长的旺盛阶段，施氮会抑制其根瘤的固氮作用，且硝态氮对根瘤固氮的抑制作用要高于铵态氮。但是在紫花苜蓿苗期有效根瘤不多或者刈割后光合作用较弱时，其根瘤固氮不能满足植物生长需求，依然需要补充相应氮素[8,34]。本研究在过程中监测了各处理下的结瘤率，发现在苗期有效根瘤不多，因此植株对氮的需求主要靠外源氮素补充。

本研究还发现氮素积累量在第1 茬时与土壤速效磷、速效钾、全氮和硝态氮含量呈显著正相关关系，在第2 茬时与土壤速效钾、全氮和硝态氮含量呈显著正相关关系，与土壤pH 呈显著负相关关系，到了第3 茬时，仅与土壤硝态氮和全氮含量呈显著正相关关系。说明随着刈割茬次的增加，紫花苜蓿对氮素的积累由对土壤氮、磷、钾养分的依赖转为对土壤氮素形态的依赖，即随着刈割茬次的增加，要适当为紫花苜蓿补充氮素，尤其是硝态氮的供应才能保证它对氮素的积累。由于在紫花苜蓿生产中是否需要施氮肥一直存在争议，持反对观点的认为施氮会抑制根瘤形成、增加土壤酸性、促进杂草生长、降低苜蓿的竞争力[7]。本研究的结果认为适量适时施氮，尤其是选择恰当的外源氮素形态是有利于紫花苜蓿的生长和持续利用的。此外，今后进一步研究氮素转化过程中不同酶的活性、功能微生物的作用，通过微生物途径增强氮素有效性，提高植物对氮素的吸收、利用和积累，能够降低化学氮肥的负面作用。

4 结论

本研究结果表明在pH 7.3～8.6 的中性偏碱性土壤中，不同形态氮素对紫花苜蓿生长及氮素积累和利用的影响各有差异，单施硝态氮和混合态氮更有利于紫花苜蓿的产量和对氮素的吸收、利用和积累。生长第1 年的苜蓿在不同茬次对土壤养分变化的响应不同，刈割第2 茬是紫花苜蓿生长和对氮素利用的最佳时期，随着刈割茬次的增加，紫花苜蓿对氮素的依赖增强，建议在刈割第2 茬后补充硝态氮或混合态氮以保障其产量和植株氮含量，从而提升饲用品质。