臭豆腐卤水中的主要发酵菌株及发酵研究

范博望，任翊，樊青青，周易枚，慕妮，陈丹丹

（南通市食品药品监督检验中心，江苏南通 226000）

臭豆腐是我国典型发酵食品之一，富含易被人体吸收的蛋白质和氨基酸，具有很高的营养价值。而制作臭豆腐用到的卤水则是使用竹笋、苋菜梗、香菇、豆豉等植物性原料，经过清洗、蒸煮、发酵而成，不同卤水底料制作的臭豆腐散发出的风味不同[1]。

目前，关于臭豆腐卤水中微生物的研究报道很多，但对于臭豆腐卤水中微生物的构成并不多见，并且由于制作工艺的不同，不同地区的臭豆腐卤水中微生物种群可能存在较大差别[2]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验样品为南通市不同地点摊位的臭豆腐。

1.2 试剂与仪器

MRS琼脂培养基：酵母膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉浸膏10 g/L、乙酸钠5 g/L、柠檬酸氢二铵2 g/L、葡萄糖20 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、硫酸镁0.2 g/L、硫酸锰0.25 g/L、琼脂20 g/L，pH 6.8。营养琼脂培养基：酵母膏1 g/L、蛋白胨2 g/L、NaCl 5 g/L、琼脂15 g/L，pH 7.4。LB培养基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物 5 g/L、NaCl 10 g/L，pH 7.4。

SW-CJ-2FD型洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；YXQ-LS-100SⅡ型灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；BagMixer均质拍打器，法国Interscience公司；GNP-9270BS型隔水式电热恒温培养箱，海门市恒昌仪器厂；TGL-16M台式高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；DHG-9240A电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 臭豆腐卤水中主要微生物的分离

取臭豆腐卤水25 mL倒入225 mL经过灭菌的生理盐水（0.85%，m/V）中，均质拍打1 min，取1 mL悬浮液于灭菌生理盐水中10倍梯度稀释至10-7，取其中10-5～10-7梯度，经MRS琼脂培养基和营养琼脂培养基多次划线分离后获取单菌落[3]，经过LB培养基过夜培养，将菌体悬浊液离心弃去上清，送上海生工测序[4]。

1.3.2 接种发酵

以自然发酵编号0为对照，将数量最多并且平板形态特征不同的6株菌编号S1～S6，混合菌株（混合比例为1∶1∶1∶1∶1∶1）编号S7，加入豆腐中培养发酵（37 ℃好氧），对每种菌株的生长进行菌落计数，观察记录菌落计数结果[5]。

1.3.3 感官评价

选取具备专业背景的候选者12名组成感官评定小组，从形态、颜色、香气等方面进行感官评定，感官评分标准见表1。

表1 臭豆腐感官评定标准

2 结果与分析

2.1 臭豆腐卤液中主要微生物的分离鉴定

对卤水中的微生物进行分离，得到大量不同形态和数量的菌落，菌落形态如表2所示，表明卤水中所含有微生物数量和种类都较多[6]。

表2 臭豆腐卤水LB培养基上的菌落形态

2.2 细菌16S rRNA基因测序鉴定

选取平板上生长数量最多的6种形态的菌落，交由上海生工测序，经比对得知，菌株S1为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），S2为明串珠菌（Leuconostoc），S3为巴黎链球菌（Streptococcus lutetiensis），S4为融合魏斯氏菌（Weissellaconfusa），S5为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），S6为吉氏库特菌（Kurthiagibsonii）[7]。

2.3 臭豆腐接种发酵

在6种单独菌株发酵的臭豆腐样品中，枯草芽孢杆菌的菌体浓度最高，或许是由于发酵条件更适合菌体生长[8]。对比6株菌株的单独发酵，混合菌株菌体浓度不是最高，但是培养基风味最为浓郁。由此可见，混合菌株接种发酵能够赋予臭豆腐最复杂的风味，菌群共同作用才能更好地促进臭豆腐发酵[9]。混合菌种在接种后48 h后枯草芽孢杆菌逐渐成为优势菌群，其次为明串珠菌、植物乳杆菌，巴黎链球菌、吉氏库特菌、融合魏斯氏菌数量较少。

2.4 感官评定结果

表3是对自然发酵、6种菌株单独发酵以及混合菌株发酵制得实验样品进行感官评价的结果。由表3可以看出，单菌株发酵感官评价得分都不高[10]，其中枯草芽孢杆菌（S5）得分最高。香气评分中，混合菌（S7）得分最高，巴黎链球菌（S3）次之[11]。感官的差异可能和不同菌种的酶活力相关，枯草芽孢杆菌作为胞外蛋白酶活力较高的菌株，感官鉴定中香气得分较高可能与此有关[12]。从结果中可以看出，单一菌株对臭豆腐的香气、色泽、形态影响有限，很难同时兼顾。而多种菌株共同作用时，则存在较好的互补作用。

表3 臭豆腐样品感官评价结果

3 结论

本实验以臭豆腐卤水为研究对象，通过微生物分离纯化，对臭豆腐制造过程中的发酵菌株进行了分离，并通过测序确定了其中数量最多的6种微生物分别是植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、明串珠菌（Leuconostoc）、巴黎链球菌（Streptococcus lutetiensis）、融合魏斯氏菌（Weissella confusa）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和吉氏库特菌（Kurthia gibsonii）。在相同发酵条件下，分别使用纯种菌及混合菌株进行臭豆腐发酵实验，单一菌株发酵所得臭豆腐感官评定结果不如混合菌株。在纯种菌株发酵中，枯草芽孢杆菌发酵制得臭豆腐样品成色较好，风味最为浓郁。