水杨酸处理对镉胁迫下孔雀草组织显微结构的影响

刘玉婷，敖雯雯，廖海民，陈琳，韩淑梅

（贵州大学 生命科学学院，贵州贵阳 550025）

随着工业化及城镇化进程的不断推进，电子垃圾和工业废弃物大量排放，同时矿业开采、电池制造等工业废水持续侵蚀土壤，造成了现今土壤重金属污染形势日趋严峻的局面，重金属元素含量表现出不同程度的富集[1-2]。土壤中的镉（Cd）由于可溶性强、来源广泛且易被植物吸收后进入食物链并最终导致人体致毒致癌，成为首当其冲的重金属污染源，引起了国内外的广泛关注[3-4]。有研究表明，我国耕地镉污染率高达25.20%，远超铅、铜、锌、镍和铬等土壤重金属元素[5]。目前，可用于修复土壤镉污染的方法主要有化学修复和生物修复，生物修复中的植物修复具备能耗低、效率高且二次污染少等特点，被认为是最具应用前景的修复措施[6]。孔雀草（Tagetes patula L.）属于菊科万寿菊属一年生草本植物，是一种耐贫瘠、管理成本低的观赏性植物，具有很强的Cd耐受性，属于Cd超富集植物[7]。然而在不施加任何外源强化剂的条件下，孔雀草对土壤中Cd的吸收易受浓度限制、耐受有限。为提升土壤镉污染修复能力，引入适宜的强化剂已成为有力的促进措施[8]。

水杨酸（Salicylic Acid，SA）被认为是受胁迫条件下植物体诱导产生抗性的信号分子，能通过多种途径减缓Cd胁迫的毒害作用，包括调节植物生长、减少Cd吸收及其分布、保护植物细胞膜结构的完整性和稳定性以及强化植物体抗氧化防卫系统的功能[9-10]。Shi等人[11]在对Cd胁迫下生长的火麻仁幼苗外施SA处理后，测定其生长参数、Cd累积量、光合作用强度等参数后证实SA能有效抵抗Cd胁迫对植物生长造成的抑制作用。Ting等人[12]选择Cd敏感及Cd耐受型番茄植株作为研究对象，发现SA与Fe离子及生长促进类微生物联合使用也能促进植物根、茎及叶生物量的累积。当前针对SA处理植物修复镉污染的研究虽多，但直观了解水杨酸处理对Cd胁迫下的孔雀草细胞结构变化的研究却并不多见。文章探究了SA处理对Cd胁迫下的孔雀草组织细胞显微结构的影响，为后期镉污染治理研究提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 研究材料

1.1.1 镉污染土壤

供试土壤为营养有机土，不含金属物质。按照Cd浓度100 mg/kg称取氯化镉（CdCl2·2.5H2O）溶于适量蒸馏水中并浇灌土壤，蒸馏水处理组作为阴性对照组，每日搅动，平衡2个月后待用。

1.1.2 镉超富集植物孔雀草

选取大小均一且饱满的孔雀草种子用75%乙醇消毒2 min，蒸馏水冲洗数次后浸种24 h，播种于穴盘中。待孔雀草长出4片叶后，选取长势一致的幼苗移入已平衡完毕的各处理组土壤中。

1.2 试剂与仪器

智能内校分析天平，福州华志科学仪器有限公司；HHQ-2508 轮转式切片机,金华市华海科教仪器厂；KD-H 烘片机，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司；BX53DIC+DP73 OLYMPUS光学显微镜，奥林巴斯有限公司。

乙醇、冰乙酸，分析纯，成都市科龙化工试剂厂；甲醛、二甲苯，分析纯，西陇化工股份有限公司；番红、固绿，北京索莱宝科技有限公司；中性树胶，国药集团化学试剂有限公司；镉标准品，上海易恩化学技术有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 水杨酸（SA）处理

配制浓度分别为0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L的水杨酸溶液（记为T1、T2、T3及T4组），待孔雀苗移栽后，每隔5 d喷施各处理组SA溶液，且每个处理组每次喷施的量保持一致，移栽50 d后收获。同时设置无Cd胁迫且不施加SA处理（TC）和Cd胁迫下生长且不施加SA处理（T0）的两组对照。每个处理5个重复，每个重复保苗2株，用于后续制片及观察。

1.3.2 孔雀草植株各组织石蜡切片

对“1.3.1”植株进行取材后，将各组材料置于FAA固定液中固定，乙醇逐级脱水，番红预染，二甲苯透明，石蜡包埋。再经切片、脱蜡及复水等操作后，1%番红及1%固绿双重染色，中性树胶封片。OlympusBX53生物显微镜镜检，并于数码成像系统下观察并拍照保存。

2 结果与分析

2.1 水杨酸处理对孔雀草根显微结构的影响

如图1所示，正常环境下不受镉胁迫也无外源SA处理影响的孔雀草根的组织细胞结构应如对照TC组所示，主要由表皮、皮层、中柱三部分组成。其中，表皮细胞排列紧密，皮层由多层薄壁细胞构成，细胞排列较疏松，中柱主要由初生木质部、初生韧皮部及木韧间薄壁细胞等部分组成，细胞排列规则，整体显微结构完整。对照T0组，生长于含镉污染土壤中，且不经过水杨酸喷施处理，表皮细胞明显破裂，细胞壁增厚，皮层薄壁细胞解体，中柱部分仅木质部细胞结构保留较完整，且细胞壁也有增厚情况。说明在浓度为100 mg/kg镉污染条件下，孔雀草根受到明显的毒害作用。而SA处理后（T1、T2、T3与T4）的各组细胞和组织结构的完整性较T0组都有提升，尤其T2组除皮层薄壁细胞形状欠规则且排列较疏松以外，与未受镉污染胁迫的Tc组的细胞形态组织结构完好程度基本一致。

图1 孔雀草各处理组根石蜡切片显微结构（10×物镜）

在对施加外源SA处理的各组材料进行观察对比，各组孔雀草根的表皮细胞排列紧密性及完好程度按照T2、T3、T1、T4的顺序逐渐降低，皮层薄壁细胞逐步解体，同时中柱各细胞结构完整性也随之降低。综上说明，对于提升孔雀草根组织结构完整性和抗损伤修复能力而言，各SA处理组的表现为T2＞T3＞T1＞ T4。

2.2 水杨酸处理对孔雀草茎显微结构的影响

如图2所示，正常生长条件下孔雀草茎的组织细胞结构由表皮、皮层、维管柱3部分组成。表皮是茎最外层形状略扁平的细胞紧密排列而成，且细胞外壁有一层角质层；皮层位于表皮与维管柱之间，主要由薄壁细胞组成，排列较疏松，靠近表皮的为厚角组织，由几层不均匀增厚活细胞组成；维管柱中韧皮部、木质部、髓和髓射线等组织细胞结构完整、界限清晰。T0组中表皮组织细胞出现明显破损，髓及髓射线的薄壁细胞发生裂解和解体；维管束中韧皮部及木质部间存在组织分离现象，间隙较大。细胞的规则性和完整性显著降低，仅能基本保持细胞的完整性。同时Cd胁迫各组最外层角质层及维管束细胞壁均有加厚。

图2 水杨酸处理对孔雀草茎显微结构的影响 (10×物镜)

对各处理组茎组织细胞结构进行对比分析可以看出，T2组各部分组织结构完好，维管束细胞充盈排列致密，没有明显损伤；而后依T3、T1、T4顺序观察，各组孔雀草茎的表皮细胞都出现不同程度受损，皮层细胞愈加疏松不规则，髓部细胞逐渐解体破裂，维管束间组织分离现象也越愈突出。说明以上各组材料所受镉胁迫影响逐渐增大，即各SA处理组缓解镉胁迫对孔雀草茎组织结构损伤的效果表现为T2＞T3＞T1＞ T4。

2.3 水杨酸处理对孔雀草叶片显微结构的影响

如图3所示，Tc组孔雀草叶片腹面及背面分别由一层紧密排列的上下表皮细胞构成，紧挨上表皮的栅栏组织呈栅栏状紧密排列，其下方海绵组织细胞形状不规则，排列疏松。叶片主脉部分主要由上表皮下方的维管束、薄壁组织及厚角组织组成。在100 mg/kg镉毒害条件下，T0组叶片表皮细胞及主脉薄壁细胞出现大面积破损，栅栏组织呈现出明显的不均匀积聚增厚的现象，栅栏组织内部、栅栏组织与海绵组织间的间隙也显著增大。

图3 水杨酸处理对孔雀草叶显微结构的影响（20×物镜）

将各SA处理组间叶片组织细胞结构的对比分析后可以看出，自T2、T3、T1、T4顺序观察，T2组在同样受到100 mg/kg镉胁迫，但施加0.2 mmol/L SA处理条件下，孔雀草叶片基本不受镉毒害影响，各部分组织及细胞结构保持完好。而后各组均有细胞解体现象，且愈加明显，并逐步出现表皮细胞解体、局部栅栏组织增厚及组织间隙增大的情况。图3证明水杨酸各处理组中孔雀草叶片所受镉胁迫毒害程度大小为T4＞T1＞T3＞T2。即各组水杨酸对孔雀草叶片抗性修复能力的促进效果表现为T2＞T3＞T1＞ T4。

重金属毒害会影响植物的生长发育、细胞超微结构、物质代谢及体内抗性酶的活性。在镉污染土壤中，可溶性Cd2+被孔雀草根系吸收进入植株组织细胞中，可与植物体新陈代谢过程中的关键活性酶蛋白上的金属元素发生竞争取代反应引起酶催化反应受阻，干扰正常代谢过程，从而强烈抑制植物体的正常生长代谢，造成植株发育迟缓、叶片萎黄、根系坏死以及细胞的显微结构发生变化，完整性明显降低。这也是本实验结果中出现各类细胞变形解体、组织分离、细胞形状及排列不规则等现象的主要原因。有研究证明，环境非生物胁迫会影响植物的显微结构，如张晓勇的研究表明，在冷害胁迫下，枇杷表皮细胞会发生挤压、表皮断裂、细胞壁降解、细胞结构模糊等现象[13]。

本实验结果发现镉胁迫下的各组孔雀草根表皮及中柱部分尤其木质部细胞出现了细胞壁增厚现象，茎的最外层角质层及维管束细胞壁也有加厚，同时叶片主脉维管束中均有不同程度的木质部细胞壁增厚和栅栏组织的积聚增厚。Vollenweider等人[14]曾发现镉处理样品的大部分组织存在细胞壁明显增厚现象，且叶片的栅栏组织和海绵组织在镉处理样品中表现出活力下降、表皮细胞塌陷及叶肉细胞部分坏死的情况。张树森等[15]的研究表明，在Pb、Cu、Zn、Cd、Hg等重金属胁迫下,紫叶稠李的解剖结构呈现出栅栏薄壁细胞组织厚度逐渐增大、海绵组织薄壁细胞逐渐分化、栅栏组织与海绵组织的比值增大等一系列变化。造成孔雀草细胞壁增厚的主要原因可能是组织通过细胞壁吸附Cd2+，并通过沉积作用阻止重金属进入细胞，从而引起Cd2+在细胞壁上的累积[16]。此外，施加SA也可诱导细胞壁中木质素含量升高，致使细胞壁增厚，从而增强细胞抵御病原入侵的能力。

正常条件下，植株在受到镉毒害时自身也会有相应的耐受和抵抗机制，镉胁迫发生的同时植物体内会诱导胁迫响应蛋白基因的表达，产生抗性蛋白，提高植株防卫镉毒害的能力。这也是实验中孔雀草根、茎、叶组织在施加SA处理后，其显微结构的完整性得到一定程度提升的原因。但不同浓度的SA处理缓解镉毒害的效果不尽相同，各处理组整体表现为T2＞T3＞T1＞T4。说明T2组在100 mg/kg Cd+0.2 mmol/L SA时，孔雀草生长出现增效效应。即适宜浓度的SA处理对一定程度的镉毒害有显著缓解作用。因此在一定浓度的镉污染土壤中施予适宜浓度的SA来种植孔雀草是提升土壤镉污染修复能力的一个有力强化措施，这对于未来进一步将孔雀草应用于治理土壤重金属镉污染具有推动作用，具备一定的经济效益及生态效益。

实验过程中，Cd+SA组合对孔雀草的影响可能存在拮抗机制，两者交互作用复杂。同时，SA对镉污染毒害的缓解作用也是有限的，通过考察4个SA浓度点与100 mg/kg Cd对孔雀草的交互影响，发现在0.2 mmol/L的SA处理时，各组织显微结构完整性较好，而后随SA浓度升高完整性反有降低，并不排除过高浓度SA反而会给孔雀草显微结构造成损伤的可能。

3 结论

通过观察孔雀草组织的显微结构，发现在100 mg/kg镉污染土壤中，缓解Cd毒害的最佳SA浓度为0.2 mmol/L。然而仅停留在显微结构的观察是不够的，后期还可增加多影响因素的考查，并结合进一步的电镜观察研究，以期深度了解SA处理对孔雀草超微结构的影响，从亚细胞水平揭示SA增强孔雀草镉抗逆性的机理。