水稻类成花素家族成员OsFTL5 和OsFTL6双突变体的创建与分析

刘晓男，宇文铭玥，郝宏姣，田 瑶，王 鑫，兰志鹏，张泗举，梁闪闪，马 轩，栾维江

（1.天津师范大学生命科学学院，天津300387；2.天津师范大学天津市动植物抗性重点实验室，天津300387）

水稻的产量受到多种农艺性状的影响，其中之一是抽穗期/开花期.水稻需要在合适的时间抽穗才能保证较好的产量，抽穗太早会导致植株营养生长不足，抽穗太晚植株容易遭受低温而导致减产.因此，研究水稻抽穗时间的调控机制对于提高水稻产量具有重要意义.水稻抽穗时间受到外部环境因素和内源基因的共同调节[1-2]：环境因素主要是日照时间的长短，短日照促进抽穗，长日照则抑制抽穗；内源基因涉及以成花素基因为核心的基因调控网络.成花素是植物开花的决定因子，植物中第一个克隆的成花素基因是拟南芥FLOWERING LOCUS T（FT），之后其同源基因在多种植物中被克隆，并且证明成花素基因在促进植物开花方面的功能是保守的[3-5].成花素是一类小分子球状蛋白，属于PEBP 家族.成花素在叶片中合成，之后转运到植物茎顶端分生组织中，与FD 和14-3-3 蛋白形成异源六聚体Florigen Activation Complex（FAC），启动成花身份基因OsMADS14 和OsMADS15 的表达[6-7].水稻中有19 个PEBP 家族成员，根据聚类分析的结果，这些基因可分为3 个亚家族，即FT-like、TFL-like 和MFT-like[8-9].FT-like 亚家族的13 个成员（OsFTL1～Os-FTL13）中，OsFTL2/Hd3a 和OsFTL3/RFT1 是已知的能够分别在短日照和长日照下起作用的成花素基因，最近有研究表明，过量表达OsFTL10 也可以促进抽穗[10-12]，其余10 个成员的功能未知.在其他物种中的研究表明，FT-like 成员既有促进开花的功能，也有抑制开花的功能. 如长日照植物二穗短柄草中FTL9在短日照下促进开花，而在长日照下抑制开花[13]；日中性植物番茄中的FT-like 基因SlSP5G、SlSP5G2 和SlSP5G3 抑制开花，而SlSP3D/SFT （Single Flower Truss）促进番茄开花[14].

要研究特定基因的生物学功能，需要创制相应的突变体.近年来，人们开发了多种可以对特定基因进行编辑的方法，主要有锌指核酸酶技术（zinc finger nuclease，ZFN）、转录激活因子类效应因子核酸酶技术（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）和规律间隔成簇短回文重复序列技术（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR-Cas）[15-18].ZFN 和TALEN 技术分别通过锌指蛋白和类转录激活因子效应物识别DNA 序列，利用融合的具有核酸酶活性的FokⅠ结构域对识别位点之间的双链DNA 进行切割，实现染色体双链断裂而产生突变.CRISPRCas 技术根据其关联蛋白（Cas）的作用方式不同而分为数种，其中最常用的是CRISPR-Cas9.该技术通过表达一条单链引导RNA（single guide RNA，sgRNA）和一个蛋白（Cas9）对基因进行编辑，其中sgRNA 负责识别靶点序列，Cas9 蛋白负责切割DNA 双链.无论采用何种方式使双链断裂，生物体都可通过非同源末端连接修复机制或同源重组修复机制进行修复，修复过程中可产生碱基的缺失或插入突变，得到相应的突变体.与ZFN 和TALEN 相比，CRISPR-Cas9 系统设计简单，作用高效，并且容易实现对多个基因同时进行编辑，已被广泛应用于包括水稻在内的多种动植物的反向遗传的研究[19].

为了研究水稻FT-like 亚家族中未知成花素基因的功能，本研究利用CRISPR-Cas9 技术对该家族中2个高度相似的成员OsFTL5 和OsFTL6 基因进行基因编辑，创建OsFTL5 和OsFTL6 的双突变体，为揭示其功能提供材料.

1 材料与方法

1.1 实验材料

本研究以粳稻（Oryza sativa spp.Japonica）品种中花11（Zhonghua11）为转基因受体，获得CRISPR-Cas9基因编辑转基因材料.

1.2 靶位点选择

靶点设计遵循以下几个原则：①靶位点一般为20 个碱基，其下游需要有一个原初间隔序列毗邻基序（protospacer adjacent motif，PAM），即NGG 的结构特征，故靶点选择应该符合（N）20NGG 的特征；②20 bp 的靶位点序列需要在同一个外显子上，GC 含量在40%～60%之间，以提高sgRNA 与靶点的结合；③选择的靶点特异性要高，以降低潜在的脱靶率；④靶位点最好位于关键结构域中.

首先将目标基因OsFTL5 和OsFTL6 的编码序列输入靶点设计在线辅助网站（https：//skl.scau.edu.cn/targetdesign/）[20]，得到了数十个候选靶点，再根据以上设计原则进行人工筛选. 最终在OsFTL5 基因的第1个外显子和第4 个外显子上设计了2 个高特异性靶点5T1 和5T2，在OsFTL6 基因的第1 个外显子上设计了1 个高特异性靶点6T1.3 个靶点的序列如表1所示.

表1 OsFTL5 和OsFTL6 的CRISPR-Cas9 靶点序列及特征Tab.1 Sequence and characteristics of targets of OsFTL5 and OsFTL6 for CRISPR-Cas9 editing

1.3 CRISPR-Cas9 载体构建

以含有sgRNA 和启动子的载体为模板，分别用靶点5T1、5T2 和6T1 的上下游引物进行PCR 扩增，将启动子、靶点和sgRNA 依次连接构建成为U6b：：5T1-sgRNA、U6c：：5T2-sgRNA 和U6a：：6T1-sgRNA. 通过BsaⅠ将U6a：：6T1-sgRNA、U6b：：5T1-sgRNA 和CRISPRCas9 载体进行酶切并用T4 DNA 连接酶进行连接，获得重组载体P1，将U6a：：6T1-sgRNA 和U6c：：5T2-sgRNA 一同连接进CRISPR-Cas9 载体获得重组载体P2.连接产物进行热激转化后，挑取单克隆进行菌液PCR 验证，将阳性菌液提取质粒，进行酶切验证，获得重组质粒.

1.4 转基因植株的获得及分子鉴定

将构建好的载体导入到农杆菌中，通过农杆菌介导的遗传转化法获得转基因植株，转基因步骤参照Zhang 等[21]描述的方法进行.获得的转基因植株进行移栽，待植株生长健壮后，用CTAB 法提取水稻叶片基因组DNA，用载体中特异性筛选标记基因（潮霉素抗性基因）进行PCR 分子鉴定.PCR 扩增体系：Taq DNA Polymerase 0.2 μL，10× Taq Buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.5 μL，5 μmol/L Hyg-F 1 μL，5 μmol/L Hyg-R 1 μL，水稻基因组DNA1μL，以ddH2O 补充体系至20μL.PCR扩增程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 个循环；72 ℃终延伸7 min；4 ℃保存.

1.5 转基因植株的突变类型分析

以OsFTL5 和OsFTL6 基因组序列为参考，分别设计包含OsFTL5 基因靶点5T1、5T2 和OsFTL6 基因靶点6T1 的特异性检测引物，如表2 所示，进行PCR 扩增.对产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并测序，测序结果用BioXM2.6 软件和在线解码工具DSDecode（http：//skl.scau.edu.cn/dsdecode/）[20]进行分析，确定转基因植株的编辑类型.

表2 OsFTL5 及OsFTL6 基因编辑位点的检测引物及序列Tab.2 Sequence of primers for identifying the OsFTL5 and OsFTL6 gene editing sites

2 结果与分析

2.1 OsFTL5 与OsFTL6 基因结构比较

OsFTL5 与OsFTL6 同属于FT-like 基因家族，两者基因结构相同，均含有4 个外显子和3 个内含子，如图1（a）所示.其开放阅读框（ORF）均为525 bp，共编码174 个氨基酸.序列比对发现，两者编码序列同源性高，序列一致率达到83.81%，所编码氨基酸序列一致率高达91.95%，如图1（b）所示.进一步分析发现，OsFTL5 和OsFTL6 的4 个外显子长度分别相同.第1个外显子为192 bp，两者碱基序列一致率达到83.33%；第2 个外显子为62 bp，两者碱基序列一致率最高，达到95.16%；第3 个外显子为41 bp，两者碱基序列一致率达到82.93%；第4 个外显子为230 bp，两者碱基序列一致率为81.30%.但是比较2 个基因的内含子序列发现，两者序列差异巨大.OsFTL5 的第1 个内含子长度比OsFTL6 的长574 bp，第2 个内含子长度比OsFTL6的短20 bp，第3 个内含子长度比OsFTL6 的长49 bp.

图1 OsFTL5 和OsFTL6 的基因结构及氨基酸序列比较Fig.1 Structure of OsFTL5 and OsFTL6 gene and comparison of the amino acid sequence

由于OsFTL5 和OsFTL6 所编码的氨基酸序列高度相似，可能存在着功能上的冗余，因此本研究创建这2个基因的双突变体，以便研究其功能.

2.2 OsFTL5 和OsFTL6 基因的CRISPR-Cas9 载体构建

根据靶点设计原则，在OsFTL5 基因上设计2 个靶点，分别位于第1 个外显子上（图1（a），5T1）和第4个外显子上（图1（a），5T2）.OsFTL6 基因靶点位于第1个外显子上（图1（a），6T1）.将设计好的靶点序列进行BLAST 比对，结果表明设计的3 个靶点序列特异，GC 含量适中，符合要求.将3 个靶点分别连接到sgRNA表达盒中，获得3 个靶点的融合表达盒U6b：：5T1-sgRNA、U6c：：5T2-sgRNA 和U6a：：6T1-sgRNA. 然 后 将U6b：：5T1-sgRNA 和U6a：：6T1-sgRNA 融合表达盒经酶切回收，连接到CRISPR-Cas9 载体中，获得含有OsFTL5基因5T1 靶点和OsFTL6 基因6T1 靶点的重组载体P1；同理将U6c：：5T2-sgRNA 和U6a：：6T1-sgRNA 融合表达盒经酶切回收，连接到CRISPR-Cas9 载体中，获得含有OsFTL5基因5T2 靶点和OsFTL6 基因6T1 靶点的重组载体P2.对获得的重组载体P1 和P2 进行菌液PCR 鉴定，结果表明二者都扩增出了预期的目的片段，如图2（a）所示.进一步对2 个重组载体进行酶切鉴定，结果表明重组载体P1 和P2 均切出了预期的目的条带，如图2（b）所示，与菌液PCR 结果一致.上述结果表明，OsFTL5 和OsFTL6 基因的3 个靶点组合已经成功连接进含有Cas9 的目的载体中，可用于下一步的转基因实验.

图2 OsFTL5 和OsFTL6 基因CRISPR-Cas9 表达载体的构建Fig.2 Construction of CRISPR-Cas9 vector for OsFTL5 and OsFTL6

2.3 CRISPR-Cas9 转基因植株获得及编辑类型分析

将构建完成的2 个CRISPR-Cas9 重组载体分别转入农杆菌EHA105，并将其导入水稻中花11 的愈伤组织中，通过含有潮霉素的培养基筛选及分化，长出小苗后移入土中生长，共获得56 株P1 载体转化的转基因植株和41 株P2 载体转化的转基因植株.对获得的转基因植株进行PCR 检测，结果显示97 株转基因植株全部可以扩增出重组载体上的潮霉素标记基因，表明重组载体已成功转化到水稻中，获得了转基因阳性植株.

为了确定转基因植株是否发生了编辑，本研究对获得的97 株转基因植株进行测序分析.其中P1 载体转化的56 株阳性植株中有38 株发生了不同类型的突变，均为OsFTL5 和OsFTL6 双编辑的植株.其中靶位点5T1 有11 种不同类型的突变，靶位点6T1 有14种不同类型的突变，均包括杂合突变、纯合突变和双等位突变.对上述突变体进行鉴定，得到3 株纯合双突变体并做进一步分析，分别命名为ftl5ftl6-1、ftl5ftl6-2和ftl5ftl6-3.P2 载体转化的41 株阳性植株中，靶位点5T2 没有发挥功能，未产生编辑植株，6T1 靶位点产生了30 株编辑突变植株，有12 种不同类型的突变，包含杂合突变、纯合突变和双等位突变.通过鉴定获得2株OsFTL6 单编辑的纯合突变植株并做进一步分析，分别命名为ftl6-1 和ftl6-2.

P1 载体产生的3 株OsFTL5 和OsFTL6 双突变体中，ftl5ftl6-1 突变体对于OsFTL5 来说是缺失1 bp 的纯合突变，在OsFTL5 的PAM 区前3 bp 处缺失1 个T碱基，如图3（a）所示；对于OsFTL6 来说是含有缺失和插入的双等位突变，测序结果为套峰，如图3（b）所示，一条同源染色体在OsFTL6 的PAM 区前4 bp 处增加1 个A 碱基（图3（b），ftl5ftl6-1-6T1-allele1），另一条同源染色体在PAM 区前4 bp 处缺失5 个碱基（图3（b），ftl5ftl6-1-6T1-allele2）.ftl5ftl6-2 对于OsFTL5 来说是双等位突变，测序结果显示套峰，如图3（c）所示，一条同源染色体的PAM 区前3 bp 处缺失1 个T 碱基（图3（c），ftl5ftl6-2-5T1-allele1），另一条同源染色体的PAM 区前4 bp 处插入1 个A 碱基（图3（c），ftl5ftl6-2-5T1-allele2）；对于OsFTL6 来说是1 个缺失10 bp 的纯合突变体，在OsFTL6 的PAM 区前12 bp 处缺失10个碱基，如图3（d）所示.ftl5ftl6-3 突变体对于OsFTL5来说是缺失1 bp 的纯合突变，在PAM 区前3 bp 处缺失1 个T 碱基，如图3（e）所示；对于OsFTL6 来说是缺失8 bp 的纯合突变，在PAM 区前9 bp 处缺失8 个碱基，如图3（f）所示.

图3 编辑突变体的测序结果分析Fig.3 Sequencing analysis of edited mutants

P2 载体产生的2 株OsFTL6 单编辑突变体中，ftl6-1 突变体是缺失4 bp 的纯合突变体，在靶点PAM区前6 bp 处缺失4 个碱基，如图3（g）所示；ftl6-2 突变体是缺失17 bp 的纯合突变体，如图3（h）所示，在靶点PAM 区前7 bp 处缺失17 个碱基.

2.4 突变体的遗传分析

为了获得可以稳定遗传的纯合突变体，将收获的T0代种子播种，获得了T1代的突变体植株.以ftl6-2为例，T0代植株为OsFTL6 纯合缺失17 bp 的单编辑突变体，通过自交产生了T1代突变体植株.提取T1代植株的DNA，设计片段大小为258 bp 的检测引物进行扩增. 将PCR 产物用3%的琼脂糖凝胶进行电泳，结果如图4 所示. 由图4 可以看出，ftl6-2 的T1代的21 个突变植株全部为OsFTL6 纯合缺失17 bp 的单编辑突变体.进一步对PCR 产物进行测序，测序结果与胶图结果一致，这表明突变体的编辑结果能够稳定遗传到下一代.获得的纯合编辑突变体可用于进一步的功能研究.

图4 T1 代编辑突变体PCR 检测Fig.4 PCR detection of T1 generation edited mutant

2.5 突变体的氨基酸序列分析

野生型OsFTL5 基因和OsFTL6 基因的编码序列长度均是525 bp，编码的蛋白含有174 个氨基酸，分别为图5（a）中的WT-OsFTL5 和图5（b）中的WT-OsFTL6.利用DNAMAN 软件对发生基因编辑的突变植株的氨基酸序列进行分析，发现ftl5ftl6-1、ftl5ftl6-2 和ftl5ftl6-3突变体造成了OsFTL5 和OsFTL6 基因不同程度的移码突变，并最终导致蛋白质翻译的提前终止，如图5所示.OsFTL6 单基因突变的2 个突变体中，OsFTL6 因发生碱基缺失也造成移码突变，从而使翻译提前终止，产生了截短的产物.综上，无论双编辑突变体还是单编辑突变体，均造成不同程度的移码突变，最终导致蛋白质翻译的提前终止而产生截短的产物，缺失过多的氨基酸可能会造成蛋白功能的丧失.

图5 野生型与突变株系的氨基酸序列比较Fig.5 Comparison of amino acid sequences between wild type and mutants

3 讨论与结论

水稻中FT-like 基因家族共有13 个成员，其中研究得最为清楚的是Hd3a，在短日照条件下，Hd3a 会与14-3-3 和转录因子OsFD1 结合形成开花激活复合体FAC，并结合到开花身份基因OsMADS14 和OsMADS15的启动子区调控OsMADS14 和OsMADS15 的转录，从而促进水稻开花[6-7].该家族中其他成员的功能尚不清楚.为了研究其他未知基因的功能，本研究用CRISPRCas9 技术成功地对FT-like 家族的2 个高度同源的成员OsFTL5 和OsFTL6 同时实现了基因编辑，得到了3个ftl5ftl6 双突变体和2 个ftl6 单突变体.3 个双编辑突变体中有双等位突变和纯合突变2 种编辑类型，OsFTL5 的突变形式主要为单碱基插入和单碱基缺失，OsFTL6 的突变形式主要为单碱基插入和5～10 bp 的小片段缺失.2 个ftl6 单编辑突变体为4 bp 的小片段缺失和17 bp 的大片段缺失突变体.这些突变体由于碱基缺失或插入均造成移码突变，导致翻译的提前终止.遗传分析表明，这些突变体都可以稳定遗传到后代，因此这些突变体都可以用于后续的基因功能分析.后期将利用产生的纯合的双突变体和单突变体材料，详细分析OsFTL5 和OsFTL6 基因在水稻中的功能.本研究结果发现，不同靶点所导致的基因编辑效率存在差异. 无论是P1 载体还是P2 载体转化的植株中，OsFTL6 基因6T1 靶点都发生了有效编辑. 但在OsFTL5 基因的2 个靶点中，5T1 靶点产生了编辑的突变体，而5T2 靶点没有得到编辑突变体植株.在前人研究中也得到了类似结果.如朱恺毓[22]对甘蓝型油菜中BnaCLV1、BnaCLV2、BnaCLV3 和BnaRPK2 基因分别设计了4 个、4 个、2 个和4 个不同的靶点，共获得4 个重组载体产生编辑突变体.对各靶点的突变情况进行分析后发现，BnaCLV1 基因的T4 靶点、BnaCLV2的T3 靶点、BnaCLV3的T2 靶点和BnaRPK2 的T4 靶点完全失效.究其原因，可能和靶点区的DNA 结构有关：一方面由于不同靶点邻近域DNA 的序列和结构有所不同，可能造成gRNA 与模板的识别结合效率有所差异，从而造成其编辑效率的差异；另一方面，不同靶点区域的序列可能与Cas9 蛋白结合的稳定性有关，从而造成不同靶点的编辑效率不同.

综上所述，本研究为水稻中类成花素家族成员OsFTL5 和OsFTL6 基因功能的研究提供了很好的基础材料.接下来将通过研究这5 个材料的表型，分析OsFTL5 和OsFTL6 基因的功能以及二者是否有功能上的冗余.