凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）ATG3 基因克隆及其在WSSV 感染中的表达

尹文娟，刘 芳，孟凡娟，张广成，王丽燕，孙金生

（1.天津师范大学生命科学学院，天津300387；2.天津师范大学天津市动植物抗性重点实验室，天津300387）

凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）是我国重要的对虾养殖品种，近年来受对虾病害频繁发生的影响，对虾养殖业遭受了重大经济损失，尤以病毒性疾病发生最为严重[1].其中，白斑综合症病毒（white spot syndrome virus，WSSV）是对虾养殖业的主要病毒性病原之一.多项研究表明，自噬在病毒侵染增殖中具有重要作用[2-4]. 自噬作为一种溶酶体降解途径，是实现细胞内物质与能量平衡的一个重要的细胞学过程.在酵母中已鉴定出超过36 种自噬相关基因（autophagy related gene，ATG），其中大部分在哺乳动物中存在相应的同源基因[5-6].自噬相关基因参与到调控自噬机制的整个过程当中，包括自噬泡的形成、自噬体膜的延伸、自噬小体与溶酶体融合以及自噬溶酶体的降解等[6-8].自噬的发生主要是依靠2 个泛素样蛋白系统和Ⅲ型磷脂酰肌醇3 磷酸激酶.ATG3 蛋白是自噬发生过程中的一种类泛素化E2 蛋白，在LC3 蛋白的脂化系统中起重要作用[9].ATG3 在自噬调节中作为关键基因扮演多重角色，其一是信号通路激活的关键蛋白，其二是自噬小体形成的关键调控基因[10].节肢动物中，果蝇Aut1是ATG3 的同源基因，RNA 干扰Aut1 基因后，果蝇的自噬水平下调[11]；叶滨[12]通过RNA 干扰家蚕ATG3 和ATG8 基因或利用CRISPR/Cas9 技术敲除ATG3 和ATG8 基因后，发现家蚕的细胞自噬水平降低，而超表达ATG3 和ATG8 基因后细胞的自噬水平升高，说明ATG3 在节肢动物细胞自噬过程中发挥了重要作用.

本研究根据凡纳滨对虾的转录组数据设计引物，以凡纳滨对虾血细胞为模板进行PCR 扩增，克隆获得了凡纳滨对虾自噬相关基因ATG3 的序列（LvATG3），对其进行生物信息学分析并构建系统进化树.进一步对LvATG3 基因的组织分布特性进行研究，并利用荧光定量PCR 技术检测凡纳滨对虾的自噬相关蛋白ATG3 在病毒感染后的表达变化，以此了解该基因在对虾先天免疫过程中的作用，同时也为其他自噬相关基因的研究提供实验基础.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

凡纳滨对虾：天津市水产研究所增殖站，体质量为（5.6±3.5）g，体长为（10.1±1.3）cm.实验前放在循环水系统内暂养3 d，养殖温度为25 ℃，每天喂食2次.

WSSV 病毒悬液：参照文献[13]中的方法制备.

1.1.2 试剂

TRIzolTMReagent，美国Invitrogen 公司；M-MLV 反转录试剂盒，美国Promega 公司；质粒提取试剂盒及琼脂糖凝胶回收试剂盒，上海生工生物公司；pMD18-T载体连接试剂盒，大连宝生物公司；DNA Marker，北京博迈德基因技术有限公司；DH5α 感受态细胞，北京天根生物公司.本实验中引物序列由华大基因公司合成，序列信息如表1 所示.

1.1.3 仪器

PCR 仪，美国ABI 公司；GelDocTMXR 成像系统、电泳仪，美国Bio-Rad 公司；Nano Drop 2000 超微量分光光度计，美国Thermo Scientific 公司.

表1 实验所用引物序列信息Tab.1 Primer sequences used in this study

1.2 方法

1.2.1 凡纳滨对虾组织样品制备

选取7 只健康有活力的凡纳滨对虾，分别取眼柄、鳃、心脏、肝胰脏、肌肉、胃、中肠、后肠、表皮、神经、血细胞共11 种组织，保存于液氮中.

选取35 只健康凡纳滨对虾，分别注射10 μL 病毒悬液[13].另取35 只凡纳滨对虾，注射10 μL TN buffer（0.24 g Tris-HCl，22.34 g NaCl，pH 值为7.4）作为对照组.25 ℃条件下分开养殖感染组和对照组对虾，分别在注射后的6、12、24、36、48、60、72 h，各取5 只对虾的血淋巴，离心获取血细胞后冻存于液氮中.

1.2.2 凡纳滨对虾总RNA 提取及cDNA 合成

利用TRIzol 法分别提取凡纳滨对虾11 种组织及注射感染不同时间的血细胞总RNA.取1 μL RNA 进行琼脂糖凝胶电泳检测，并用Nano Drop 2000 超微量分光光度计分别测其OD 值.各样品分别取1 μg 作为反转录反应的模板，按照反转录试剂盒说明书，以AOLP 和BDA 为接头引物合成cDNA，使用随机引物合成cDNA 用于荧光定量PCR 检测.

1.2.3 LvATG3 基因克隆

根据转录组序列，设计凡纳滨对虾自噬相关基因ATG3 的全长特异性引物LvATG3-F 和LvATG3-R，以1.2.2 节中合成的cDNA 为模板进行PCR 反应.25 μL 的反应体系中包含无酶水4.25 μL、LvATG3-F 引物0.5 μL、LvATG3-R 引物0.5 μL、2×Taq PCR Master Mix 6.25 μL、cDNA 1 μL.反应条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性50 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，33 个循环；72 ℃延伸10 min，16 ℃冷却.产物在1.0%的琼脂糖凝胶上进行检测，切胶回收后与pMD18-T 载体进行4 ℃连接，转化DH5α 后挑取单菌落，送至苏州金唯智生物科技有限公司进行测序.

1.2.4 LvATG3 基因序列的生物信息学分析

在http：//web.expasy.org/compute_pi 上预测LvATG基因的等电点和分子质量；应用NCBI 的CDD 数据库（http：//www.ncbi.nlm.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分 析基因编码氨基酸的结构域特征. 应用在线翻译软件（http：//web.expasy.org/translate/）对测序结果进行氨基酸翻译；应用Clustal W 与MEGA 5.0.1 对不同物种的ATG3 蛋白进行比对和分析，构建系统进化树.

1.2.5 LvATG3 的组织表达分析

将1.2.1 中获取的11 种对虾组织的cDNA 稀释10 倍后用作模板，利用荧光定量PCR 技术检测LvATG3 在各组织中的表达. 根据内参基因18S 设计引物18S-F 和18S-R（表1），目的基因引物为LvATG3-semi-F 和LvATG3-semi-R（表1）.在25 μL 反应体系中包含10 μL SYBR、0.4 μL LvATG3-semi-F 或18S-F、0.4 μL LvATG3-semi-R 或18S-R、7.2 μL 灭菌水和2 μL 模板.荧光定量PCR 反应条件为95 ℃5 min；95 ℃10 s，60 ℃35 s，40 个循环.反应结束后导出结果，应用2-ΔΔCt（ΔΔCt=ΔCt 样品-ΔCt 对照）算法对所得数据进行计算，分析LvATG3 的相对表达量，应用SPSS 检测t 检验分析差异的统计学意义（P ＜0.05）.

1.2.6 WSSV 侵染后血细胞LvATG3 的表达分析

将1.2.1 中WSSV 病毒感染后不同时间点的血细胞cDNA 稀释10 倍后用作模板，利用荧光定量PCR检测LvATG3 对WSSV 的免疫应答反应. 荧光定量PCR 检测及分析方法同1.2.5.

2 结果与分析

2.1 LvATG3 基因克隆及序列分析

本研究利用PCR 技术克隆获得了LvATG3 的cDNA 全长，共948 bp，编码315 个氨基酸，蛋白相对分子质量为35.527×103，等电点为4.58，含有3 个自噬相关的结构域，分别是N 末端结构域、活化位点结构域和C末端结构域，如图1 所示.多序列比对如图2所示，LvATG3 编码的蛋白与节肢动物门其他物种的自噬相关蛋白具有很高的序列相似性，其中，与侧沟茧蜂（Microplitisdemolitor）、阿根廷蚂蚁（Linepithema humile）ATG3 基因编码的自噬相关蛋白的序列相似性达到71%.利用MEGA 5.0.1 软件的邻接法（Neighbor-Joining，NJ）构建系统进化树，结果如图3 所示，凡纳滨对虾的自噬相关蛋白与黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的自噬相关蛋白聚为一支.

2.2 LvATG3 的组织表达特征

利用荧光定量PCR 的方法检测了LvATG3 在凡纳滨对虾11 种组织中的表达情况，并且通过Origin 8.0软件对定量结果进行分析，结果如图4 所示.由图4 可以看出，LvATG3 基因在凡纳滨对虾的11 种组织中均有表达，其中在中肠、后肠、鳃和血细胞中的表达量较高，其次是在胃和肝胰腺中，在眼柄中的表达量最低.

图1 凡纳滨对虾LvATG3 基因全长及编码的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequence of LvATG3 gene in Litopenaeus vannamei

图2 凡纳滨对虾与其他物种自噬相关蛋白的氨基酸序列比对Fig.2 Amino acid sequence comparison of ATG3 proteins between Litopenaeus vannamei and other species

图3 凡纳滨对虾LvATG3 与其他物种自噬相关蛋白氨基酸序列的系统进化树分析Fig.3 Phylogenetic analysis of the sequences of ATG3 proteins in Litopenaeus vannamei with other species

2.3 WSSV 侵染后LvATG3 的表达特征

凡纳滨对虾感染WSSV 后不同时间在血淋巴细胞中的LvATG3 表达情况如图5 所示.由图5 可以看出，对照组中，随着培养时间的延长，LvATG3 的表达量基本稳定；实验组中，培养初期LvATG3 的表达量下降，显著低于对照组（P ＜0.05），中后期LvATG3 的表达量上升，在病毒感染后24～60 h，LvATG3 的表达量与对照组无显著差异（P ＜0.05）；病毒感染后72 h，LvATG3 的表达量显著高于对照组（P ＜0.05）.

图4 凡纳滨对虾LvATG3 基因在各组织中的表达情况Fig.4 Expression of LvATG3 in different tissues of Litopenaeus vannamei

图5 WSSV 感染不同时间后LvATG3 基因的表达Fig.5 Relative expression of LvATG3 during WSSV infection

3 讨论与结论

自噬是存在于真核生物中的一个高度保守的过程，细胞内衰老的蛋白质或多余的细胞器均可通过自噬过程被降解，以维持机体自身的稳定状态，在病原感染方面发挥的作用也越来越被重视[14].目前已经发现了很多自噬相关基因可通过影响自噬体的形成发挥调控作用，如ATG3、ATG7、ATG8、Beclin1 等[15-16].本研究成功获得了凡纳滨对虾自噬相关基因LvATG3 的cDNA 全长，通过生物信息学分析发现，LvATG3 编码的蛋白与节肢动物门其他物种的自噬相关蛋白具有很高的序列相似性，其中与侧沟茧蜂、阿根廷蚂蚁ATG3 基因编码的自噬相关蛋白序列相似性达到71%，表明LvATG3 与已报道的其他物种的ATG3 蛋白在氨基酸组成和潜在功能上无较大差异，是一种在各物种中比较保守的自噬相关蛋白，可以参与免疫过程.

LvATG3 组织表达研究显示，LvATG3 在检测的11 种对虾组织中均有表达，表明自噬是一种在对虾机体细胞中广泛存在的现象，不具有组织特异性，但其表达量在不同组织中有差异，在肠道、鳃和血细胞中表达量明显高于其他组织.Wu 等[17]指出，肠道是对虾消化系统的重要器官，连通外部环境，对于环境中致病菌的识别和清除有重要作用，也是白斑综合症病毒（WSSV）入侵的首要靶器官，血细胞在对虾的免疫防御中也发挥了重要作用.在病原入侵的过程中，血细胞及其释放的免疫因子通过吞噬、包囊和结节等作用消除病原，维持机体健康[17].本研究中凡纳滨对虾LvATG3 在这些组织中的高表达也表明其在机体的免疫反应中发挥了一定作用.

为进一步揭示自噬相关蛋白LvATG3 及自噬在WSSV 感染中的作用，本研究检测了WSSV 感染后不同时间凡纳滨对虾LvATG3 基因的表达变化，发现LvATG3 在病毒感染不同时间表达差异显著，感染初期表达下降，显著低于对照组，后期表达量上升，培养60 h 后超过对照组.推测病毒侵染调控或影响了自噬相关基因LvATG3 及其参与的细胞自噬.Sun 等[18]研究发现，病毒增殖可以利用细胞自噬：病毒侵染初期，细胞为避免病毒对其自身的利用，会相对下调自噬相关基因的表达，从而降低自噬水平；病毒侵染后期，病毒大量增殖，会反过来调控自噬过程，使自噬水平上调，自噬相关基因表达量上升.本研究结果与Sun 等的结论一致.