白蛾周氏啮小蜂CcOBP5 基因克隆、原核表达及其结合特性分析

王永辉，王 静，金 欣，郭美琪，覃东玉，刘新宇，李 敏，潘丽娜

（1.天津师范大学生命科学学院，天津300387；2.天津师范大学天津市动植物抗性重点实验室，天津300387；3.天津师范大学天津动物多样性保护与利用重点实验室，天津300387；4.漯河市豫中南林业有害生物天敌繁育研究中心，河南漯河462300）

昆虫嗅觉系统通常由气味结合蛋白（odorant binding proteins，OBPs）、化学感受蛋白（chemosensory proteins，CSPs）、神经元膜蛋白（sensory neuron membrane proteins，SNMPs）、气味受体（olfactory receptors，ORs）及气味降解酶（odor degrading enzymes，ODEs）等构成[1-2].气味分子进入感器淋巴液与其中的气味结合蛋白相结合，能够使嗅觉神经元膜上的气味受体被激活，产生动作电位，从而引起一系列相关的行为响应[3-4].气味结合蛋白能够与气味分子特异性结合，起到初步过滤气味分子的作用，是昆虫嗅觉识别过程中的关键环节.近年来，OBPs 与气味分子的结合机制受到广泛关注.如Zhang 等[5]、Li 等[6]研究发现，膜翅目昆虫中红侧沟茧蜂（Microplitis mediator）的5 种OBP 对不同的气味分子结合力不同，其中MmedOBP 的最佳配体是β-紫罗兰酮；Li 等[7]研究东方蜜蜂（Apis cerana Fabricius）的气味结合蛋白，发现AcerOBP2 与花卉挥发物和蜜蜂信息素结合紧密；Wang 等[8]研究发现，雄性传粉榕小蜂（Ficus auriculata）可能利用CsolOBP1 和CsolOBP2 通过与信息素结合来寻找雌性完成交配；Wang 等[9]研究发现，鞘翅目昆虫白蜡窄吉丁（Agrilus planipennis Fairmaire）的AplaOBP1 可与9 种植物挥发物高度结合，其中包含寄主树的5 种萜烯类化合物.

白蛾周氏啮小蜂（Chouioia cunea Yang）是世界性检疫害虫——美国白蛾（Hypanthia cunea Drury）蛹期的重要寄生性天敌，在美国白蛾的生物防治方面具有广阔前景[10-12].白蛾周氏啮小蜂主要依赖嗅觉系统识别并定位寄主，本课题组早期转录组测序发现了25 个白蛾周氏啮小蜂气味结合蛋白CcOBPs、11 个化学感受蛋白CcCSPs、1 个神经元膜蛋白CcSNMP、80 个气味受体CcORs、31 个味觉受体CcGRs 和10 个离子受体CcIRs[13-14]. 此外，本课题组对美国白蛾蛹、舞毒蛾蛹、白蜡、臭椿、泡桐以及常见植物的挥发物进行GCMS 分析，筛选得到了50 余种小分子化合物[15].

为进一步探究白蛾周氏啮小蜂雌雄个体共有的嗅觉反应机制，本研究选取在白蛾周氏啮小蜂雌雄触角均大量表达的一个气味结合蛋白CcOBP5，通过分子对接技术筛选出可与之特异性结合的气味分子.采用RT-PCR 技术克隆CcOBP5 的全长cDNA 序列，构建原核表达质粒，并诱导重组蛋白大量表达，通过荧光结合实验对分子对接筛选得到的小分子化合物的结合能力进行测定，为进一步完整揭示白蛾周氏啮小蜂的嗅觉机制积累研究数据.

1 材料与方法

1.1 供试昆虫饲养和组织收集

白蛾周氏啮小蜂由河南省漯河市豫中南林业有害生物天敌繁育研究中心惠赠，接入柞蚕（Antheraea pernyi）蛹后，在本实验室内于25 ℃、相对湿度70%的条件下扩繁. 选取在第一天孵化的雌性白蛾周氏啮小蜂，将其浸入RNA Later（美国Ambion 公司），收集于1.5 mL 离心管中.收集的所有材料均保存于-20 ℃条件下.

1.2 三维结构建模和分子对接

CcOBP5 碱基序列由本课题组前期采用转录组测序技术对雌雄白蛾周氏啮小蜂的触角进行测序获得[7]，使用Swiss-Mode（http：//swissmodel.expasy.org/）进行同源性建模[16]，获得蛋白的三维结构.随后，通过Ramachandran 图和Verify-3D 评估三维模型的质量[17-18].

从Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载小分子物质的三维结构用以进行分子对接的准备.首先将CcOBP5 的三维结构导入至Schrodinger Suites 2015-2 中的Maestro10.2 软件，手动输入蛋白三维结构具体坐标并进行调整，使蛋白的活性中心尽可能位于盒子的中心位置，生成文件后保存.然后分别将小分子物质的结构导入，对小分子物质的其他构象进行搜索，生成文件后保存.最后使用Maestro10.2 进行分子对接.

1.3 RNA 提取和克隆

使用Trizol 试剂提取总RNA. 使用TransScript RT试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）合成第一链cDNA.根据CcOBP5 的cDNA 序列，设计了正向和反向引物用于CcOBP5 片段扩增，应用BamHI/HindⅢ双酶切后，与pET-28a 载体连接构建CcOBP5-pET28a 重组质粒，并由苏州金唯智生物科技有限公司测序正确.

1.4 重组蛋白的表达与纯化

将CcOBP5-pET28a 重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中进行蛋白表达，37 ℃下用浓度0.1 mmol/L 的IPTG 诱导5 h.之后在8 000 r/min 下离心2 min，小心收集大肠杆菌沉淀，并将其重悬于裂解缓冲液（含有50 mmol/L 的NaH2PO4、300 mmol/L 的NaCl、10 mmol/L 的咪唑和1 mg/mL 的溶菌酶）中.用超声技术处理重悬的溶液，然后在12 000 r/min 下离心30 min.由于在大肠杆菌中表达的蛋白质以包涵体形式存在，为了获得可溶蛋白，首先按照变性方案用Ni-NTA-琼脂糖纯化包涵体，然后通过逐渐降低其浓度使其复性，最后使用质量分数为18%的SDS-PAGE 凝胶验证纯化的蛋白质.

1.5 竞争性荧光结合实验

选择1-N-苯基-萘胺（1-NPN）作为荧光探针并在甲醇中稀释，使浓度达到1 mmol/L.在50 mmol/L Tris-HCl（pH 值为7.4）中稀释至2 μmol/L 后，将获得的蛋白质与0～40 μmol/L 范围内不同浓度的1-NPN 混合，测量蛋白质的结合常数.激发波长设置为337 nm，发射光谱在380～500 nm 之间，通过Infinite 200 Pro 多功能酶标仪（瑞士Tecan 公司）完成此测定. 将1-NPN、2 μmol/L 获得的蛋白质和不同浓度的γ-丁内酯（0、5、10、15、20、25、30 μmol/L）混合以测量激发后的荧光变化，计算特定蛋白质与被测化合物之间的结合亲和力.从3 个独立的测量中收集结合数据.结合化学物质的饱和化学计量比为1 ∶1（蛋白质∶配体）.该评估基于荧光强度并假设蛋白质为100%活性.通过斯卡查德图对结合曲线进行线性化.使用Prism 5 分析IC50和解离常数（Kd）.抑制常数（Ki）用以下公式进行计算

式中：C1-NPN为1-NPN 的游离浓度.

1.6 行为学分析

在Y 型嗅觉仪器上测量雌性白蛾周氏啮小蜂对配体的行为响应，该仪器由中央管玻璃（直径22 mm，长115 mm）和2 个侧臂（直径22 mm，长75 mm）组成.从气泵中通入空气（200 mL/min），将每只1 日龄的成年小峰放置在Y 型管中央臂的底部30 s，同时观察它们对化合物的反应.在5 min 内没有行为反应的昆虫被排除在进一步分析之外.进入含有化合物气味源的侧臂并停留至少10 s 的受试者被确定为具有趋向性，而进入无气味的侧臂的受试者被确定为趋避性.每只小蜂测试1 次，每观察10 只，将Y 型管对调方向，以消除位置误差，每个气味标样测试50 只小蜂，测试完毕用无水酒精清洁试管并风干.

2 结果与分析

2.1 CcOBP5 同源建模及分子对接

本课题组早期通过对白蛾周氏啮小蜂触角转录组测序获得25 种OBP 蛋白序列，其中CcOBP5 的开放阅读框为408 bp，编码136 个氨基酸，相对分子质量为15.21×103，在雌雄触角中均广泛表达.为进一步研究CcOBP5 在白蛾周氏啮小蜂嗅觉识别中的作用，根据已经得到的白蛾周氏啮小蜂CcOBP5 全序列，在Swiss-Model（http：//swissmodel.expasy.org/）上对CcOBP5进行同源建模，结果如图1 所示.

图1 白蛾周氏啮小蜂气味结合蛋白CcOBP5 的三维结构Fig.1 3D structure of odorant binding protein CcOBP5 of C.cunea

白蛾周氏啮小蜂气味结合蛋白CcOBP5 的三维结构有6 个α 螺旋，分别为Glu29-Glu41（α1）、Lys46-Val53（α2）、Cys66-Ser74（α3）、Gly86-Tyr92（α4）、Val98-Cys108（α5）、Cys118-Asp134（α6），与红蝇（Phormia regina）的气味结合蛋白OBP56a（PDB-ID：5dic）的相似度最高.这2 个蛋白的一级结构差异较大，但二级结构尤其是关键的α 螺旋区氨基酸保守性较高，相似度为34%.通常情况下，模型的相似度在30%以上便可获得相对合理的构象[19].

为进一步评估模型的合理性，利用PROSA（https：//prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php）对同源建模所得的蛋白质结构模型进行能量评价，结果如图2 所示.置信度GMQE 值（0～1 之间为合理）为0.56，匹配度QMEAN 值（-4～0 之间为合理）为-1.75.拉氏构象（Ramachandran）分析结果如图3（a）所示.由图3（a）可以看出，91.7%的CcOBP5 氨基酸残基落在最佳区域（蓝色区域），6.5%的氨基酸残基落在较合理区域（紫色区域），没有氨基酸残基落在不允许区域（白色）.verify-3D 结果如图3（b）所示，89.81%氨基酸残基的3D-1D 值≥0.2，通常该模型中80%以上氨基酸残基的3D-1D 值≥0.2 即可认定模型合理.以上结果表明，此CcOBP5 的预测模型是可靠且合理的，可用于后续的分子对接实验.

图2 CcOBP5 蛋白整体模型质量Fig.2 Overall quality of CcOBP5 model

图3 CcOBP5 三维模型的拉氏构象及verify-3D 模型评估Fig.3 Rational evaluation of the established 3D model of CcOBP5 by Ramachandran plot and verify-3D

应用本课题组发现的美国白蛾蛹、舞毒蛾蛹共有挥发物以及美国白蛾咬食后白蜡、臭椿、泡桐的挥发物共52 种小分子物质与CcOBP5 进行分子对接，结果如表1 所示.由表1 可以看出，多种挥发性气味分子可能与CcOBP5 特异性结合，其中，CcOBP5 与γ-丁内酯的结合性最佳. 选取γ-丁内酯作图，结果如图4 所示. 由图4 可以看出，CcOBP5 通过Cys-38、Ile-39 和Lys-37 与γ-丁内酯形成保守氢键.

2.2 CcOBP5 基因克隆与表达

为进一步检测上述分子对接结果，以白蛾周氏啮小蜂cDNA 为模板，应用CcOBP5 基因特异性引物PCR 获得该基因片段，采用BamHI/HindIII 双酶切，构建CcOBP5-pET-28a 重组质粒，并在大肠杆菌BL21（DE3）中表达和纯化，结果如图5 所示.由图5 可以看出，IPTG 可明显诱导CcOBP5 蛋白表达（第2 泳道），而pET-28a 空质粒转化菌无相应蛋白表达（第1 泳道），应用Ni-NTA agarose 试剂盒可获得高纯度CcOBP5 蛋白（第3 泳道），该蛋白可用于荧光结合实验分析.

2.3 荧光结合实验检测CcOBP5 与挥发性化合物的结合

测定1-NPN 荧光探针与CcOBP5 结合的亲和力，结果如图6 所示，计算可得CcOBP5 的解离常数为23.44 μmol/L. 分子对接实验结果显示γ-丁内酯与CcOBP5 结合最佳，且早期研究发现γ-丁内酯是一种美国白蛾蛹挥发物[15]. 为进一步验证分子对接实验结果，通过荧光竞争结合实验发现γ-丁内酯可与CcOBP5 特异性结合，其IC50为34.72 μmol/L，抑制常数为31.99 μmol/L.

图4 分子对接显示CcOBP5 与γ-丁内酯结合Fig.4 Docking results of CcOBP5 with γ-Butyrolactone

图5 重组CcOBP5 的SDS-PAGE 分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of recombinant CcOBP5

图6 重组CcOBP5 的1-NPN 及其与γ-丁内酯的结合曲线Fig.6 Binding curves of 1-NPN and γ-butyrolactone for the recombinant CcOBP5

2.4 白蛾周氏啮小蜂对γ-丁内酯的行为学反应

为了进一步研究γ-丁内酯与CcOBP5 结合的的生物学功能，以石蜡油为对照组，使用Y 型嗅觉仪测定白蛾周氏啮小蜂对不同浓度（0.05～100.00 mmol/L）γ-丁内酯的行为学反应，结果如图7 所示.由图7 可以看出，白蛾周氏啮小蜂对γ-丁内酯的选择率随浓度升高而增加，γ-丁内酯对白蛾周氏啮小蜂的趋避作用也随着浓度升高而增强.

图7 Y 型嗅觉仪检测白蛾周氏啮小蜂对γ-丁内酯的行为学反应Fig.7 Behavioral response of female individuals to γ-butyrolactone investigated in Y-tube olfactometer

3 讨论与结论

CcOBP5 为本课题组早期通过转录组测序获得的一种在白蛾周氏啮小蜂触角中大量表达的气味结合蛋白，经Bio Edit 和HMMTop 软件分析发现，CcOBP5具有昆虫气味结合蛋白的典型特征，如相对分子质量小、具有6 个典型α 螺旋和6 个保守的半胱氨酸位点（C38、C66、C70、C108、C118、C127）等.本研究通过Swiss-Model 在线搜索建模，发现红蝇的气味结合蛋白OBP56a（PDB-ID：5dic）与白蛾周氏啮小蜂气味结合蛋白CcOBP5的相似度最高. Ramachandran 和PROSA 能量评价结果均表明模型构象合理.利用分子对接技术在美国白蛾蛹等的挥发物中初步筛选出能够与CcOBP5 特异性结合的小分子化合物，结果表明，白蛾周氏啮小蜂气味结合蛋白CcOBP5 与γ-丁内酯的结合最好，分子对接打分为-5.733 94.

本研究通过生物信息学和分子对接技术对白蛾周氏啮小蜂气味结合蛋白CcOBP5 进行了多角度的预测分析，之后通过原核表达并纯化CcOBP5 蛋白.利用荧光结合实验检测重组CcOBP5 与γ-丁内酯的结合情况，发现CcOBP5 可与γ-丁内酯特异性结合，同时白蛾周氏啮小蜂对γ-丁内酯有明显趋避反应，推测其对γ-丁内酯的趋避反应可能与CcOBP5 相关.本研究可为CcOBP5 的后续研究和进一步探明白蛾周氏啮小蜂的嗅觉机制奠定基础.