缺氧环境对新生SD大鼠神经干细胞增殖的影响及与miR-124-3p的相关性研究

林超群 范学政 邱波

【关键词】神经干细胞;缺氧环境;增殖;miR-124-3p

各国科学家于上世纪90年代开始了神经干细胞（NSCs）的深入研究，研究人员对哺乳动物脑组织进行细胞群落筛选，发现了一个不仅可以不断分裂，还具有多分化潜能的细胞群落，把它命名为NSCs。脑缺血缺氧往往会导致NSCs的细胞活力受到抑制，甚至发生凋亡，而且NSCs对缺氧环境非常敏感，缺氧环境中NSCs非常容易发生延迟死亡。研究者发现在脑缺血缺氧大鼠模型中，NSCs可依然促进大鼠神经功能的恢复，但缺氧环境中，NSCs的神经修复功能是否削弱，国内外学者并未深入研究。近20年来的研究表明NSCs增殖能力可受到miRNA的调控，目前miRNA与NSCs功能的相关性研究正在逐步深入，其中miR-124-3p被证明与NSCs增殖关系密切，miR-124-3p的高表达可靶向抑制Delta-like1（DLL1）蛋白表达，促进NSCs的增殖。但缺氧环境中，miR-124-3p与NSCs的相关性研究，国内外文献尚未报道。本研究建立缺氧NSCs模型及无缺氧NSCs模型，比较两组模型NSCs的增殖能力，并且分析miR-124-3p与NSCs的相关性，为缺氧环境中NSCs增殖的机制提供理论基础本研究建立缺氧NSCs模型及无缺氧NSCs模型，比较两组模型NSCs的增殖能力，并且分析miR-124-3p与NSCs的相关性，为缺氧环境中NSCs增殖的机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

培养基 DMEM/F12为1∶1，B27细胞补充添加剂、表皮生长因子（EGF）重组鼠源表皮生长因子及胰蛋白酶消化液来自于Gibco 公司（美国），重组鼠源碱性纤维细胞生长因素青霉素-链霉素双抗溶液来自于PeproTech公司（美国），Accutase分离液，美国Sigma-Aldrich公司、多聚赖氨酸PDL，美国Sigma-Aldrich 公司、PBS 磷酸缓冲盐溶液（pH7.2），美国Thermo Scientific公司、多聚甲醇，国药集团化学试剂有限公司、曲拉通Triton X-100来自于美国Amresco公司，小鼠抗兔多克隆抗体和兔抗小鼠IgG H&L采用美国Abcam公司、驴血清来自于美国Jackson 公司;4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色液来自于雷根生物技术有限公司（北京）、Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂盒来自于凯基生物科技发展有限公司（南京）、RNA提取试剂盒，美国Invitrogen公司。 三气培养箱，Thermo Scientific公司;二氧化碳培养箱，美国Thermo公司;倒置荧光显微镜，日本Nikon 公司;激光共聚焦显微镜，美国OLYMPUS公司。

1.2 方法

（1）原代NSCs的提取培养（胎鼠海马来源）。实验使用雌性大鼠为：孕14天SD大鼠，所有大鼠均来源于维通利华实验动物技术有限公司（北京）。使用颈部脱臼的方法，结束孕14天SD大鼠的生命，在无菌操作台，0 ℃环境中腹部解剖实验大鼠，取出胎鼠，逐步分离出胎鼠的大脑，显微镜下解剖出胎鼠海马组织，显微剪均匀海马组织加入胰酶（0.25%）进行5分钟的消化处理，再给予胎牛血清（10%）对消化过程进行终止，给予5分钟的800r离心处理，弃上清液，加入NSCs完全培养后，仔细吹打均匀重悬，过400目细胞筛网，细胞计数后，接种于细胞培养瓶中，把细胞密度调整为5×105/mL。在温度37℃，二氧化碳浓度为5%的恒温培养箱中培养，3 天换液，7 天传代，每天在显微镜下观察NSCs的状态，取第2代悬浮NSCs球进行下一步实验。

（2）NSCs免疫荧光鉴定。使用浓度为100 μg/mL的多聚赖氨酸预先包被24 孔板爬片，PBS 轻柔冲洗3次，取吹打均匀的第2代悬浮NSCs 200 μL放置在24孔爬片上，在恒温箱内培养120 min，在细胞出现贴壁反应后，4%多聚甲醛固定30 min，PBS 轻柔冲洗3 次;加入0.3%曲拉通Triton X-100通透30 min，给予PBS实施3次的轻柔冲洗，给予驴血清（10%）实施一小时的37 ℃的封闭处理，不给予清洗操作，给予一抗（小鼠抗兔多克隆抗体Nestin），4度孵育過夜;PBS轻柔冲洗3次;在避光环境下加入同源荧光二抗（兔抗小鼠IgG H&L）在室温下一小时的孵育处理，给予PBS反复3次冲洗操作;给予DAPI染核处理，再实施PBS反复3次冲洗操作，将爬片处理后放置在脱载玻片进行封片处理，用荧光显微镜对染色结果进行观察分析。

（3）CCK8试验。用Accutase分离液消化第2代悬浮NSCs球，消化充分后细胞球消失，形成多个悬浮单个细胞，对细胞浓度进行调整，在96孔内实施1×104个/孔密度的细胞设置，我们建立缺氧NSCs模型及无缺氧模型，缺氧模型为37度，50%空气，45%N2，5%CO2，的细胞培养环境。无缺氧模型为37度，5%CO2，95%空气的细胞培养环境。我们将NSCs分为无缺氧组，缺氧组，两组不同细胞分别接种于96孔板，无缺氧组在无缺氧环境中培养72小时。缺氧组在缺氧环境中培养72小时，然后每个孔给予10 μLCCK8 试剂的加入，并实施两小时的37 ℃温度下的孵育处理，对450 nm波长各孔的吸光度水平实施酶标仪的检测处理，记录数据并统计。

（4）不同缺氧环境中NSCs增殖的形态学鉴定。为了研究缺氧环境中NSCs的增殖能力，取第2代悬浮NSCs，细胞计数后，接种于细胞培养瓶中，把细胞密度调整为5×105/mL。将NSCs分为无缺氧组和缺氧组，两组不同细胞在不同缺氧环境中培养，72小时后在显微镜下观察NSCs的状态。

（5）RT-PCR检测miR-124-3p的表达水平为了检测2组不同细胞miR-124-3p的表达水平，我们收集无缺氧组及缺氧组细胞后，使用Trizol法提取RNA，以37度持续60 分钟，85 度持续5分钟进行反转录反应;然后95度预变性10 分钟;95度变性20秒;60度退火15秒，72度延伸收集30秒，一共40个扩增循环。每个样本设置3个复孔，采用2-ΔΔCt 法计算miR-124-3p基因的相对表达量，该实验重复3 次并取其均值。

1.3 统计学分析

以上各项指标给予（x—±s）进行表示，开展GraphPad8.0軟件及SPSS 22.0软件对符合方差齐性及正态分布的数据资料实施t检验的处理，当P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 原代胎鼠海马来源NSCs形态及鉴定

NSCs悬浮生长，随着增殖的NSCs逐渐融合，6～7天后，肉眼就能辨认出含有数千个细胞的大神经球（图A1～A2）。原代NSCs在体外是神经球样的，通过免疫荧光法证实表达NSCs的特异性标记蛋白Nestin（图B1～B2）。

2.2 不同缺氧环境对NSCs活力的影响

本研究采用CCKB实验评估显示，在缺氧环境中，NSCs的细胞活力明显下降（P<0.01），见图2。

2.3 两种不同缺氧环境中原代NSCs增殖培养的形态

实验分组后，72 h后在显微镜下观察NSCs的状态：无缺氧组见大多数细胞显著增殖呈悬浮聚集成球生长，只有少数细胞呈单个细胞生长。缺氧组少部分细胞成球生长，大部分仍呈单细胞生长，见图3。

2.4 缺氧环境中NSCs的miR-124-3p的表达水平

实验分组后，72 h后使用RT-PCR实验检测两组不同细胞miR-124-3p的表达水平。通过实验发现，在缺氧环境中，miR-124-3p的表达量明显下降，见图4。

3 讨论

本研究的目的是探讨缺氧环境对新生SD大鼠NSCs增殖的影响，并且分析miR-124-3p与NSCs的相关性，为缺氧环境中NSCs增殖的机制提供理论基础[1-2]。本研究结果表明，在缺氧环境中，新生SD大鼠NSCs增殖受到明显抑制[3]，并且NSCs中miR-124-3p的表达量高低与不同缺氧环境具有相关性[4]。

自从1992年Reynolds首次提出NSCs的概念后，通过NSCs治疗神经系统疾病，给脑损伤后神经功能的恢复带来了新希望。miR-124-3p作为中枢神经系统特异性的miRNA，在NSC 的增殖与向神经性分化过程中，起着关键性的作用[5]。研究证明，miR-124-3p的高表达可靶向抑制Delta-like1（DLL1）蛋白表达，促进NSCs的增殖，在NSC 的维持与神经再生中起关键作用[6].。在本研究中，我们建立缺氧NSCs模型的建立，证实了缺氧环境对NSCs增殖的影响非常大，同时也明确了miR-124-3p的表达量与缺氧环境的相关性，但miR-124-3p具体通过何种通路，在缺氧环境中调控NSCs的增殖机制研究，本研究并未明确，需要进一步研究来揭示这一机制。本研究有一定的局限性。由于本研究是在体外进行的，因此在体内缺氧环境中进一步NSCs的增殖机制仍有必要[7-8]。

综上所述，在缺氧环境中，新生SD大鼠NSCs增殖受到明显抑制;NSCs中miR-124-3p的表达量高低与不同的缺氧环境具有相关性。