扶正口服液通过STAT3-RORγt信号通路对胃癌小鼠Th17细胞的调控作用

王理槐 孙银辉

【关键词】胃癌;扶正口服液;信号转导与转录激活因子3;维甲酸相关核孤儿受体γt;辅助性T细胞17

近年来，有关胃癌患者其辅助性T细胞17（T helper cell 17，Th17）、信号转导与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）及维甲酸相关核孤儿受体γt（retinoid-related orp han nuclear receptor γt，RORγt）表达增加的报道相继涌现[1-2]。基础研究亦证实了白细胞介素-17（IL-17）具有较强促瘤作用，IL-17抑制剂或可成为胃癌治疗的新思路[3]。扶正口服液是我院肿瘤科长期临床探索中研制而成的院内制剂，该方以李东垣“补脾胃、泻阴火”学说为指导，具有健脾益气、活血散结之功。本研究基于本院采用扶正口服液辅助治疗胃癌的确切疗效，研究扶正口服液通过STAT3-RORγt信号通路调控胃癌荷瘤小鼠Th17细胞分化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及药物

SPF级KM小鼠50只，雌雄各半，体重18～22 g，6～8周龄，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。动物使用符合我校《实验动物管理规定》。

扶正口服液每1000 mL含：莪术220 g、生丹参147 g、当归147 g、黄连44 g、蒲公英440 g、白花蛇舌草440 g、党参147 g、蜜麸炒白术147 g、生甘草88 g、制半夏147 g、陈皮88 g、白茯苓176 g。将扶正口服液以生理盐水稀释至0.45 g/ mL，根据换算系数，小鼠等效給药量为0.2 mL/10 g，并依此设置低剂量、中剂量、高剂量（0.1 mL/10 g、0.2 mL/10 g、0.4 mL/10 g）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

将人胃癌细胞株SGC-7901置于含10%灭活胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养液中，细胞单层贴壁生长至80%～90%融合时以0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3传代，于37℃、5%CO2、湿度合适的细胞培养箱中培养。

1.2.2 动物造模

取对数生长期的人胃癌SGC-7901细胞株，在无菌条件下分别用0.25%胰蛋白酶消化制备成3×107个/mL细胞悬液，以0.1 mL/只接种于50只裸小鼠右侧腋窝下。待肿瘤生长至100～200 mm3后，选取合适裸小鼠40只备用。

1.2.3 分组及给药

将40只荷瘤小鼠随机分为空白组，阳性对照组（5-FU组），低、中、高剂量组，每组8只。空白组：生理盐水灌胃，每次剂量为0.2 mL/10 g，1次/d;另腹腔注射生理盐水，每次剂量为0.1 mL/10 g，2次/周。5-Fu组：将5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）以生理盐水稀释至5 mg/mL，腹腔注射给药，每次剂量为0.1 mL/10 g，2次/周;另以生理盐水灌胃，每次剂量为 0.2 mL/10 g，1次/d。低、中、高剂量组：生理盐水稀释后的扶正口服液灌胃，低、中、高剂量组每次剂量分别0.1 mL/10 g、0.2 mL/10g、0.4 mL/10 g，1次/d;另腹腔注射生理盐水，每次剂量为0.1 mL/10 g，2次/周。给药28天后，将小鼠摘除眼球取血，手术剥取瘤块。

1.3 指标观察

瘤体体积：给药前后测量瘤体最长径（a）和最短径（b），并根据公式V=πab2/6（mm3）算出瘤体体积。

肿瘤抑制率：计算肿瘤的生长抑制率=（Cweight-Tweight） /Cweight×100%，Tweight为给药组小鼠体积、Cweight为空白组小鼠平均体积。

STAT3、RORγt 信使RNA（mRNA）的表达：采用RT-PCR法检测，将肿瘤组织剪碎并加入Trizzol冰上匀浆，抽提RNA并测定浓度，进行RT-PCR反应，检测STAT3 RORγt mRNA的表达情况。反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃25 s，55 ℃ 25 s，72 ℃ 50 s，72 ℃5 min，循环次数为40，设GAPDH作为内参照。引物设计见表1。

STAT3、RORγt的蛋白表达：采用Western Blot法检测，将肿瘤组织剪碎后加入RIPA裂解液并在冰浴条件下超声匀浆裂解后加入PMSF及Complete 液，4℃12000rct离心15min得到蛋白样品，应用BCA分析试剂测定蛋白浓度，50 μg蛋白质在SDS-PAGE 电泳分离，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，一抗4℃过夜，TBST洗膜3次，加入二抗室温孵育2 h，TBST洗膜3次。以GAPDH蛋白的表达为内参照。

血清IL-17、IL-22、IL-6水平采用ELISA法检测，试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司，操作严格按照说明书执行。

1.4 统计学方法

应用SPSS 22.0软件处理，计量资料采用（x—±s）表示，多组间比较采用方差分析。检验水准为α=0.05，当P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组瘤体体积比较

给药后，5-FU组，低、中、高剂量组瘤体体积均小于空白组，5-FU组瘤体体积均小于低、中剂量组，5-FU组瘤体生长抑制率均高于低、中剂量组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。

2.2 各组STAT3、RORγt mRNA表达情况

中、高剂量组STAT3、RORγt mRNA表达量均低于空白组、5-FU组、低剂量组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表3。

2.3 各组STAT3、RORγt蛋白表达情况

中、高剂量组STAT3、RORγt蛋白蛋白表达均低于空白组，差异均有统计学意义（P<0.05），见图1。

2.4 血清Th17相关炎症因子水平

低、中、高剂量组血清IL-17、IL-22、IL-6水平均低于空白组，中、高剂量组血清IL-17、IL-22、IL-6水平均低于5-FU组和低剂量组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表4。

3 讨论

根据胃癌临床表现，可将其归属于中医“积聚”范畴，其多由饮食不节日久致胃失和降或痰热毒瘀交阻于胃而成，病机总属虚实夹杂，因此当健脾益气以补虚，活血散结以祛邪[4]。

本研究中，给药后，5-FU组，低、中、高剂量组瘤体体积均小于空白组，5-FU组瘤体体积均小于低、中剂量组，5-FU组瘤体生长抑制率均高于低、中剂量组。表明中、高剂量的扶正口服液对于胃癌小鼠均有抗癌抑瘤作用，剂量越高，效果越明显，高剂量的扶正口服液效果与胃癌常用的抗肿瘤药5-氟尿嘧啶无明显差别。扶正口服液组成为莪术、丹参、当归、黄连、蒲公英、白花蛇舌草、党参、白术、半夏、陈皮、茯苓、甘草。其中党参、当归可补气养血，白术、茯苓健运脾胃，以除胃癌病久之虚，莪术、丹参活血行气，半夏、陈皮燥湿化痰，蒲公英、白花蛇舌草散结消癥，与黄连合用还可清热解毒，甘草调和诸药，固护胃气，诸药合用则补气养血与健脾护胃并举，痰、湿、瘀、热、毒共治，扶正与祛邪兼顾[5-7]。

研究证实[8-9]，Th17在胃癌患者中明显升高，其释放的炎性介质可促进肿瘤新生血管的形成，同时还可导致Th17/Treg的免疫失衡，进而加重胃癌患者的免疫抑制，促进胃癌细胞的生长、侵袭。Th17细胞主要分泌IL-17、IL-22、IL-6等促炎因子发挥促炎作用，诱导肿瘤进展，同时IL-6分泌过多，还可使抑炎因子TGF-β负相调控T细胞，使其向Th17分化，减少Treg细胞数量，加重机体炎症反应[10-11]。而STAT3-RORγt信号通路与Th17的分化及促炎机制密切相关，STAT3是Th17增殖的信号转导通路代表因子，而RORγt则是其特异性转录因子，当STAT3功能亢进时，STAT磷酸化增加，并可提高bcl-2和bcl-xL對机体炎症细胞的抗凋亡作用，促进T淋巴细胞增殖及毒性T细胞反应，进而增加Th17细胞的分化及加重机体炎症损伤。此外，STAT3上调还可激活RORγt的过度表达，已有研究[12]显示，RORγt缺乏小鼠，其Th17细胞数量明显低于正常小鼠，而在初始T细胞中加入编码RORγt的逆转录病毒，可明显促进IL-17、IL22等Th17相关因子的分泌。

本研究还显示中、高剂量组STAT3、RORγt mRNA均低于空白组、5-FU组和低剂量组，蛋白表达量均低于空白组，此外，低、中、高剂量组血清IL-17、IL-22、IL-6水平均低于空白组，中、高剂量组血清IL-17、IL-22、IL-6水平均低于5-FU组和低剂量组。表明扶正口服液可通过下调STAT3、RORγt表达，抑制Th17细胞分化，减少Th17相关细胞因子分泌，抑制Th17细胞分化，进而发挥抗癌作用，其效果与剂量相关，较低剂量时无明显作用。而5-氟尿嘧啶则无此调控作用，其抗癌机制与扶正口服液并不相同。

综上所述，高剂量扶正口服液可下调STAT3、RORγt的表达，进而抑制胃癌小鼠Th17的分化发挥抑瘤作用。