茶粉均质性的红外光谱相似度评价研究

伍贤学，李 明，李亮星，邓秀娟，马宪英，李亚莉，周红杰*

1.云南农业大学龙润普洱茶学院,云南 昆明 650201 2.玉溪师范学院化学生物与环境学院，云南 玉溪 653100 3.昆明易武鸿庆茶业有限责任公司,云南 昆明 650000

引 言

红外光谱法是一种经典的有机结构分析手段，近年来越来越广泛的用于生物医药、石油化工、农业食品等诸多混合物分析领域，具有直接、简单、快速、低碳等优点[1]。研究表明，指纹性和可解析性是混合物红外光谱的两个基本属性。近十多年来，孙素琴等在中药、食品等复杂体系的红外光谱分析领域进行了系统研究并取得一系列成果，奠定了混合物红外光谱分析的理论基础[2-3]。

准确的信号是定性和定量分析的基础，是实现分析结果准确可靠的前提[4]。非均质样品的均质化处理不足可能严重影响分析结果的可靠性，特别是对于单次取样量低至毫克甚至微克的固态样品红外光谱分析更是如此。茶叶和其他很多复杂固体样品一样，属于典型的非均质样品。粉碎是茶叶分析的常规前处理环节，我国国家标准(GB/T 8303)也对茶样预处理过程中的粉碎环节进行了相应规定。但不论是茶叶水浸出物、茶多酚、游离氨基酸、总生物碱等常规理化分析，还是茶叶中儿茶素、茶氨酸、咖啡因或香气成分分析，单次分析的取样量(或预处理取样量)通常都在1 000 mg以上，而茶粉的红外光谱(KBr)测试单次取样量约1 mg甚至更低。因此，直接利用常规成分测定所需的茶样粉末进行红外光谱测试，所得光谱可能无法准确反映茶样的整体信息，以此为基础的红外光谱分析可能存在较大的误判风险。非均质样品的红外光谱分析中的这一问题尚未引起足够重视，从诸多文献的红外光谱图上可以看出较为普遍的存在样品量过载、基线倾斜、信噪比偏低等不太注重红外光谱质量的现象[5-8]。迄今为止亦鲜见红外光谱分析对样品均质化程度要求的有关报道。本课题组近年来一直从事茶叶等复杂样品红外光谱相关研究[9-10]。研究发现，弄清高质量红外光谱对茶粉均质化程度的要求对于茶叶的红外光谱深入研究十分必要。得益于光谱软件技术及化学计量学方法的发展成果，利用红外光谱相关系数(r)可以方便地对光谱相似度进行评价[1]。

云南是世界茶树原产地中心地带。具有独特的云南大叶种茶树资源优势，拥有普洱生茶、普洱熟茶、滇红茶等特色鲜明的茶叶品种。三类茶叶产品均由云南大叶种茶树幼嫩芽叶经不同工艺加工而成，三类茶可以分别归为不发酵茶、后发酵茶和全发酵茶，茶叶化学组成存在显著差异。

为此，以三类滇产茶为实验材料，通过红外光谱相似度评价茶叶粉碎粒径对红外光谱质量的影响，优化茶叶均质化粉碎条件，以便于尽可能少的光谱采集次数获取可靠的红外光谱分析信号，为基于茶叶红外光谱分析的相关研究打下坚实的基础。预期研究成果可为茶叶的红外光谱研究过程中的样品均质化前处理实验提供科学指导，也可为其他非均质固态样品的红外光谱分析提供参考。

1 实验部分

1.1 样品处理

选取普洱生茶(Raw-PE)、普洱熟茶(Riped-PE)、滇红茶(YNBT)三类茶样作为研究对象，所有茶样均由昆明易武鸿庆号茶叶有限公司提供。

各取茶样100 g，除尘后盛于烘样铝盒中于60 ℃的烘箱中干燥4 hrs。取出冷至室温后，匀堆取出10 g用多功能粉碎机(国产)粉碎2 min，茶粉依次过60，120和250目不锈钢分样组筛，制得A(60目以下)、B(60～120目)、C(120～250目)及D(250目以上)四种不同粒径范围的茶粉，分装收集编号后于干燥器中保存备红外光谱测试用。

1.2 仪器参数及方法

PE Frontier型傅里叶变换红外光谱仪(Perkins-Elmer)；通用金刚石单点衰减全反射红外光谱附件(UATR)；氘代硫酸三甘氨酸酯(DTGS)检测器；KBr法光谱扫描范围：4 000～400 cm-1；ATR法光谱扫描范围：4 000～650 cm-1；光谱分辨率为4 cm-1，累计扫描16次，扫描时自动扣除H2O和CO2的干扰；每个茶样平行测试五次；原始红光谱依次执行T-A转换、基线校正、归一化等标准化处理后用于光谱相似度评价。光谱采集及处理利用PE公司红外光谱专业软件(Spectrum 10.4)完成；光谱相似度评价采用PE红外光谱软件自带Compare软件完成，优选光谱评价范围为1 800～700 cm-1。

透射法(KBr)红外光谱测定：取茶样粉末约1 mg与约100 mg溴化钾碎晶(光谱纯，自贡三川公司)混合研磨均匀后放入压片模具，8吨压力下保持2 min，随后将样品片用样品夹固定后放入样品仓进行测试。

ATR法红外光谱测定方法：取少许茶粉置于金刚石UATR平台，压力杆保持在同一压力条件下测试。

2 结果与讨论

2.1 全体茶样间的红外光谱相似度评价

为从总体上了解不同茶类、粒径茶样之间的相关性，以普洱生茶250目以上粒径样品的第五次平行KBr光谱为参比，对3类茶样、4种粒径各5个平行样共60个KBr谱的1 800～700 cm-1波数段进行相似度评价，相关系数(r)均以夹角余弦值计算，即

其中，每个红外光谱(光谱矩阵x的一行)被视为由n个可变坐标产生的n维空间中的向量，两个光谱之间的相似性由两个向量之间夹角的余弦定义；wk为扣除水蒸气和二氧化碳的吸收干扰的噪声权重因子。评价结果见表1。

首先，从表1可见，以Raw-PE<250-5的KBr谱为参比，普洱生茶的相关系数范围为1.000 0～0.993 2，滇红茶与普洱熟茶相应的相关系数范围分别为0.930 0～0.756 3和0.644 7～0.562 9，3类茶的相关系数范围存在显著差异，容易通过相似度评价进行区分，20条滇红茶光谱中与参比光谱相关性最好的为YNDH 250-2(r=0.930 0)，普洱熟茶的为Riped-PE 120-5(r=0.644 7)。对20条类内光谱对应的相关系数变化幅度进行考察，发现除了普洱生茶的变化幅度小于1%之外，普洱熟茶的达到8%，滇红茶的更是超过17%。该结果说明粉碎粒径对不同茶类均质性影响明显不同，这可能与三个茶样的加工原料老嫩程度不同有关。

表1 不同茶类、粒径茶样的红外光谱(KBr)相似度评价结果Table 1 Similarity evaluation results of different tea samples based on FTIR (KBr) spectra

2.2 不同粒径、茶类及光谱采集方式的红外光谱差异分析

图1给出了3类滇产茶的4种粒径茶粉共60条KBr谱重叠图，图2是相应的ATR谱重叠图。所有红外光谱均按实验方法所述进行标准化处理并选取1 800～700 cm-1波数范围进行相似度评价，不同谱线用不同颜色、线型标记，标记详情见图注。从图1可以看出，三类茶样呈现出明显不同的红外光谱吸收特征，吸收峰差异在3 500～3 000和1 600～1 000 cm-1范围内表现得最为明显，普洱生茶的吸收峰相对最强、普洱熟茶的吸收峰相对最弱。还可看出，不同茶类间的谱线趋于分离，而同类茶间的谱线则更趋于聚拢重叠，3类茶中滇红茶光谱表现相对较差。图2中三类茶呈现出与图1类似吸收特征，但在1 600～1 000 cm-1范围内光谱的类间差异更加突出、类内差异相对更小。此外，2 000 cm-1附近为ATR谱普遍存在的噪音峰，对光谱标准化处理具有一定不利影响。

图1 溴化钾法红外光谱重叠图(1 900～500 cm-1)绿色:普洱生茶;红色:滇红茶;蓝色:普洱熟茶Fig.1 Stacked plot of FTIR (KBr) spectra (1 900～500 cm-1)green:Raw-PE;red:YNBT;blue:Riped-PE

图2 衰减全反射红外光谱重叠图(1 900～600 cm-1绿色:普洱生宠;红色:滇红茶;蓝色:普洱熟茶Fig.2 Stacked plot of ATR-FTIR spectra (1 900～600 cm-1)green:Raw-PE;red:YNBT;blue:Riped-PE

光谱差异反映了茶样组成差异，可通过重叠光谱图中的谱线重叠程度直观表现，这些直观的视觉差异可以通过光谱间的欧式距离、夹角余弦值、皮尔森线性相关系数等进行量化表达。上述结果表明，3类茶样的均质化程度受粉碎粒径影响并不一致，普洱生茶的均质性最好，滇红茶的均质性最差，该评价结果与前文的结果一致。

2.3 基于平行光谱的相似度评价结果与分析

表2 KBr法的平行红外光谱相似度评价结果Table 2 Similarity evaluation based on parallel FTIR (KBr) spectra

表3 ATR法平行红外光谱的相似度评价结果Table 3 Results of similarity evaluation based on parallel ATR-FTIR spectra

上述结果表明，粒径、茶类及光谱采集方式均可能影响光谱相似度评价结果。均质性与茶类相关，本研究中普洱生茶比滇红茶、普洱熟茶表现出更好的均质性；均质性与茶粉粒径成负相关，粒径越小，均质性越高；就两种光谱采集方式比较结果而言，KBr谱比ATR谱表现出更强的差异区分能力，可能更适合用于组成类似样本间的差异分析。

2.4 基于同类茶20个光谱间的相似度评价结果与分析

前文平行光谱评价结果表明茶样的均质性与茶粉粒径呈负相关，250目以上茶样的均质性最好。故以250目以上茶样光谱为参比对来自于同类茶、不同粒径的20个光谱进行相似度评价，并以下划线标记出与参比相似度较低的r值(<0.99)。表4、表5分别为基于KBr谱和ATR谱的评价结果，表中还分别给出了同粒径、同茶类以及同一光谱采集方式的r均值。

从表4、表5可以看出，普洱熟茶、滇红茶及普洱生茶20个KBr谱的r值中低于0.990 0的分别有10，10及0个，而相应的ATR谱结果分别为6，13及4个。值得注意的是，43个低于0.990 0的r值中，除了3个源于滇红茶120目以上样品的ATR谱之外，其余40个全部源于120目以下的茶样。基于KBr谱的同类茶比较，(rRaw-PE(0.997 7)>(rRiped-PE(0.980 2)>(rYNDH(0.970 9)，相应的ATR谱结果为(rRaw-PE(0.992 3)>(rRiped-PE(0.991 8)>(rYNDH(0.987 6)。基于KBr谱的同粒径比较结果为(rD(0.999 4)>(rC(0.996 7)>(rB(0.983 6)>(rA(0.952 0)，相应的ATR谱结果为(rD(0.999 2)>(rC(0.992 8)>(rB(0.988 8)>(rA(0.981 6)。此外，60个KBr谱r均值为0.991 6，低于相应的ATR谱均值0.993 3。

表4 同类茶、不同粒径的20个KBr谱的相似度评价结果Table 4 Similarity evaluation of the same kind of tea samples with different particle sizes based on 20 IR spectra (KBr)

表5 同类茶不同粒径的20个ATR谱的相似度评价结果Table 5 Similarity evaluation of the tea samples with same type but different particle sizes based on 20 ATR-FTIR spectra

该评价结果进一步表明普洱生茶相对于另外两种茶样具有更好的均质性。更重要的是，结果表明粉碎粒径大小可能严重影响茶粉的均质化程度，利用粉碎均质化程度不足(120目以下)的茶粉红外光谱分析茶叶化学组成可能导致光谱不能真实反映样本化学组成信息。两种光谱采集方式结果对比分析表明，KBr谱对样品间的组成差异反映更为灵敏，更适合组成高度相似的同类样本间的差异识别与分析。

3 结 论

对3类滇产茶样的不同粒径茶粉进行KBr法和ATR法红外光谱的一系列相似度评价研究。不同茶类对比表明，普洱生茶茶样比普洱熟茶和滇红茶茶样的均质化程度更高，这可能与加工普洱熟茶、滇红茶的茶箐原料比普洱生茶原料稍显粗老、茶梗木质化程度稍高有关。不同光谱采集方式研究结果表明，虽然ATR平行光谱表现出更好的重现性，但KBr谱明显具有相对更好的样品间差异识别能力，更适合用于茶叶产品这样的组成高度相似的同类样本间的差异识别与分析。对不同粒径茶粉的研究结果表明，茶粉的均质化程度与茶粉粒径密切相关，粒径越小，均质化程度越高。非均质样品的充分均质化前处理是取得可靠分析结果的基本保障，这对于单次测试取样量低至1 mg的红外光谱(KBr)分析而言尤为如此。一般而言，120目以上的茶粉粒径可让KBr谱达到r>0.995，但若基于ATR谱进行分析，最好将茶样粉碎至250目以上。

值得指出的是，虽然样品的均质化程度和样品间的组成差异可以方便地通过红外光谱相似度进行量化评价，但对于具体分析样本而言，研究确定可靠的相似度评价阈值非常重要，简单利用相似度评价结果可能存在潜在的误判风险。