人类8型疱疹病毒与胃肠型HIV卡波西肉瘤组织ORF42、mTORC1表达相关性研究

黄晓玲， 周 洁， 孔文洁， 高 峰

1.新疆维吾尔自治区人民医院消化科，新疆 乌鲁木齐 830001；2.新疆医科大学第八附属医院肝病科

卡波西肉瘤是一种以梭形细胞增生和血管瘤样病变为特征的恶性肿瘤，在临床较为少见。有研究报道，艾滋病患者中卡波西肉瘤发病率高达40%，又称HIV相关卡波西肉瘤，且死亡率较高[1]。由于近年来艾滋病发病率呈逐年上升趋势[2]，探究HIV相关卡波西肉瘤相关影响因素对评估患者病情及预后仍有重要意义。卡波西肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus，KSHV)又称人类8型疱疹病毒(human herpesvirus 8，HHV8)，具有潜伏性和裂解性，HHV8感染是影响卡波西肉瘤发生的重要因素[3]。有研究证实，ORF42是HHV8裂解蛋白，能促进HHV8大量增殖和病毒基因表达形成[4]。Pringle等[5]研究表明，HHV8可刺激哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)活性或破坏自噬，使其参与HHV8裂解复制过程。mTORC1和ORF42分别是疱疹病毒合成过程的早期和晚期有代表性的蛋白[4]。HIV相关卡波西肉瘤多发于口腔黏膜、淋巴结、肝脏、胃肠道、骨骼等部位[1]，目前研究多集中于口腔黏膜、皮肤等，而胃肠道部位研究少见报道，本研究通过检测胃肠型HIV相关卡波西肉瘤组织中HHV8感染及ORF42、mTORC1表达水平，分析HHV8感染与ORF42、mTORC1表达水平相关性，初步探究三者在卡波西肉瘤进展中的作用和意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2015年9月至2019年9月新疆维吾尔自治区人民医院收治的HIV合并胃肠型卡波西肉瘤患者36例作为研究对象，男21例，女15例，年龄(42.63±7.19)岁(28～61岁)。纳入标准：(1)经消化道内镜及病理学检查，确诊为胃肠型卡波西肉瘤[6]。(2)经实验室检查为HIV-1抗体阳性[7]。(3)临床资料完整。(4)患者及其家属对本研究知情并签署知情同意书。排除标准：(1)合并其他恶性肿瘤。(2)入组前接受过抗肿瘤治疗。(3)合并感染性及自身免疫性疾病。入组患者根据卡波西肉瘤病理分期，分为斑片期8例，斑块期15例，结节期13例。本研究经本院伦理委员会批准同意(批号：1506002)。

1.2 主要仪器和试剂qRT-PCR仪(型号：ABI7900，美国ABI公司)、光学显微镜(型号：DM4000，德国徕卡公司)、RNA提取试剂盒(货号：R1200-100，北京Solarbio公司)、反转录试剂盒(货号：RP1105，北京Solarbio公司)、SYBR®PrimeScriptTMRT-PCR试剂盒(批号：RP1100，北京Solarbio公司)、免疫组织化学染色试剂盒(货号：11719386001，德国Roche公司)、HHV8单克隆抗体(货号：orb302189，英国Biorbyt公司)、Anti-β-actin(货号：A1978，美国Sigma公司)、Anti-ORF42(货号：ab220155，美国Abcam公司)、Anti-mTORC1(货号：ab2732，美国Abcam公司)。

1.3 方法

1.3.1 样本采集：留取入组患者卡波西肉瘤组织及瘤旁组织(距肿瘤边界≥0.5 cm)，一部分经石蜡包埋制成切片，另一部分经液氮迅速冷冻后于-80 ℃保存。

1.3.2 胃肠型HIV卡波西肉瘤及瘤旁组织中HHV8表达检测：采用免疫组织化学染色检测胃肠型HIV卡波西肉瘤组织及瘤旁组织中HHV8表达情况。严格按照免疫组织化学染色试剂盒说明书进行操作。最终所得染色切片在400倍光学显微镜下观察，由病理医师对HHV8阳性表达情况进行判断。经免疫组织化学染色，细胞核中呈棕黄色或棕褐色颗粒的细胞为HHV8阳性细胞。

染色结果根据染色强度和阳性细胞所占百分比记分判定,即半定量计分法[8]：(1)染色强度：无色、淡黄色、棕黄色、棕褐色分别记为0、1、2、3分；(2)阳性细胞所占百分比：<5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、>75%分别记为0、1、2、3、4分。两项分相乘，≤3分为阴性表达，>3分为阳性表达。

1.3.3 胃肠型HIV卡波西肉瘤组织及瘤旁组织中ORF42、mTORC1蛋白表达水平检测：Western blotting法检测组织中ORF42、mTORC1蛋白表达水平。将组织研磨后加入蛋白裂解液提取组织中总蛋白并测定蛋白总量，经过凝胶电泳分离蛋白质、PVDF转膜、质量浓度为50 g/L的脱脂奶粉室温封闭后，加入对应一抗，4 ℃条件下孵育过夜；加入二抗，室温条件下孵育1 h；显色，观察拍照。使用Quantity One 4.5软件进行半定量分析。目的蛋白相对表达水平=目的蛋白灰度值/内参β-actin灰度值。

1.3.4 胃肠型HIV卡波西肉瘤组织及瘤旁组织中ORF42、mTORC1、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)mRNA表达水平检测：采用qRT-PCR法检测胃肠型HIV卡波西肉瘤组织及瘤旁组织中ORF42、mTORC1、VEGF、IL-6 mRNA表达水平。20 μl反应体系如下：ROX 0.4 μl，Mix 10 μl，cDNA 2 μl，上、下游引物各2 μl，ddH2O 3.6 μl。反应步骤如下：95 ℃ 8 min，1个循环；95 ℃ 15 s，62 ℃ 30 s，73 ℃ 15 s，40个循环，1个样品进行3个重复。以β-actin为内参基因，采用2-ΔΔCT法计算ORF42、mTORC1、VEGF、IL-6 mRNA相对表达水平。引物序列如表1所示。

表1 qRT-PCR引物序列及扩增长度Tab 1 Primer sequence and amplification length of qRT-PCR

2 结果

2.1 胃肠型HIV卡波西肉瘤组织及瘤旁组织中HHV8阳性率胃肠型HIV卡波西肉瘤组织中免疫组织化学染色结果显示，细胞核中呈棕黄色或棕褐色颗粒，HHV8免疫染色为阳性(见图1)。卡波西肉瘤组织中HHV8阳性26例(72.22%)，瘤旁组织中HHV8阳性9例(25.00%)。卡波西肉瘤组织中HHV8阳性率高于瘤旁组织，差异有统计学意义(χ2=16.068，P=0.000)。

图1 胃肠型HIV卡波西肉瘤组织中HHV8表达情况(400×)Fig 1 Expression of HHV8 in gastrointestinal HIV Kaposi’s sarcoma (400×)

2.2 胃肠型HIV卡波西肉瘤组织及瘤旁组织中ORF42、mTORC1蛋白表达水平如图2、表2～3所示，胃肠型HIV卡波西肉瘤组织中ORF42、mTORC1蛋白表达水平明显高于瘤旁组织(P<0.05)。根据患者卡波西肉瘤组织中HHV8表达情况分为感染亚组(HHV8阳性)26例和未感染亚组(HHV8阴性)10例，感染亚组卡波西肉瘤组织中ORF42、mTORC1蛋白表达水平明显高于未感染亚组(P<0.05)。

注：A：瘤旁组织；B：未感染亚组；C：感染亚组。

表2 胃肠型HIV卡波西肉瘤组织及瘤旁组织中ORF42、mTORC1蛋白表达水平比较Tab 2 Expressions of ORF42 and mTORC1 in Kaposi’s sarcoma and peritumoral tissues of gastrointestinal HIV %)

表3 感染亚组与未感染亚组卡波西肉瘤组织中ORF42、mTORC1蛋白表达水平比较Tab 3 Comparison of ORF42 and mTORC1 protein expression in Kaposi’s sarcoma between infected subgroupand uninfected subgroup %)

2.3 胃肠型HIV卡波西肉瘤组织及瘤旁组织中ORF42、mTORC1、VEGF、IL-6 mRNA表达水平如表4所示，胃肠型HIV卡波西肉瘤组织中ORF42、mTORC1、VEGF、IL-6 mRNA表达水平明显高于瘤旁组织(P<0.05)。如表5所示，感染亚组卡波西肉瘤组织中ORF42、mTORC1、VEGF、IL-6 mRNA表达水平明显高于未感染亚组(P<0.05)。

表4 胃肠型HIV卡波西肉瘤组织及瘤旁组织中ORF42、mTORC1、VEGF、IL-6 mRNA表达水平比较Tab 4 Comparison of mRNA expression levels of ORF42, mTORC1, VEGF and IL-6 in gastrointestinal HIV Kaposi’s sarcoma and peritumoral tissues

表5 感染亚组与未感染亚组卡波西肉瘤组织中ORF42、mTORC1、VEGF、IL-6 mRNA表达水平比较Tab 5 Comparison of mRNA expression levels of ORF42, mTORC1, VEGF and IL-6 in Kaposi’s sarcoma tissues between infected subgroup and uninfected subgroup

2.4 胃肠型HIV卡波西肉瘤组织中ORF42、mTORC1与VEGF、IL-6相关性如表6所示，胃肠型HIV卡波西肉瘤组织中ORF42、mTORC1 mRNA与VEGF、IL-6 mRNA表达水平均呈正相关(P<0.05)。

表6 胃肠型HIV卡波西肉瘤组织中ORF42、mTORC1与VEGF、IL-6相关性Tab 6 Correlation of ORF42, mTORC1 with VEGF and IL-6 in gastrointestinal HIV Kaposi’s sarcoma tissues

3 讨论

胃肠型HIV相关卡波西肉瘤临床表现为腹痛、腹泻、便血、体质量下降等。研究表明，病毒感染引起细胞信号传导紊乱，通过促进细胞增殖和抑制细胞凋亡诱导血管生成，是卡波西肉瘤发病的重要机制[9]。

HHV8内核含有约165 kb双链DNA基因组，属于疱疹病毒科，最早发现于HIV携带者的卡波西肉瘤组织中[10]。HHV8可参与细胞周期调控、细胞因子水平调节等多种生物学进程，分为潜伏阶段和裂解阶段。潜伏阶段基因产物主要起调控细胞周期作用，裂解阶段基因产物主要用于病毒增殖[11]。病毒在周期转化过程中引起的细胞生长因子上调和血管内皮细胞分化增加，是卡波西肉瘤发生的关键影响因素[9]。本研究结果显示，卡波西肉瘤组织中HHV8阳性率明显高于瘤旁组织，提示HHV8感染可能通过影响相关基因或蛋白表达和细胞因子表达，促进肿瘤血管生成和卡波西肉瘤发生发展。

HHV8包含开放阅读框(open reading frame，ORF)，是HHV8的同源疱疹病毒基因，ORF42属于其中一种，是在病毒颗粒中积累的晚期蛋白[4，12]。卡波西肉瘤进展中ORF42可促进HHV8病毒蛋白表达和相关因子水平升高[4]。本研究结果显示，胃肠型HIV卡波西肉瘤组织中ORF42蛋白及mRNA表达水平明显高于瘤旁组织，且感染亚组卡波西肉瘤组织中ORF42蛋白及mRNA表达水平明显高于未感染亚组。提示ORF42与卡波西肉瘤发生密切相关，且ORF42可能是HHV8高效复制的关键影响因子。

mTORC1属于mTOR的蛋白复合物之一，主要由raptor构成，在细胞周期调控中发挥关键作用，可参与肿瘤信号途径调控[13]。有研究[5]表明，mTORC1与病毒蛋白合成和病毒在裂解感染期间的自噬控制密切相关，HHV8可通过刺激mTORC1活性和利用宿主细胞机制合成病毒蛋白。本研究结果显示，与瘤旁组织比较，胃肠型HIV卡波西肉瘤组织中mTORC1蛋白及mRNA表达水平明显升高，且感染亚组卡波西肉瘤组织中mTORC1蛋白及mRNA表达水平明显高于未感染亚组，提示HHV8可能通过调控mTORC1活性及功能促进自身复制和卡波西肉瘤进展。

研究表明，HHV8感染后mTORC1可促进IL-6等促炎细胞因子和VEGF等血管生成因子表达，促进原发性积液性淋巴瘤发生发展和肿瘤耐药[14-15]。HHV8可诱导VEGF表达上调，促进肿瘤血管生成[16]。Lopes等[17]研究发现，卡波西肉瘤患者血清IL-6水平明显升高，与HIV和HHV8参与的复杂的免疫调控机制有关。本研究结果显示，胃肠型HIV卡波西肉瘤组织中VEGF、IL-6 mRNA表达水平明显高于瘤旁组织，感染亚组卡波西肉瘤组织中VEGF、IL-6 mRNA表达水平明显高于未感染亚组，提示HHV8可引起VEGF、IL-6 mRNA表达水平升高，与卡波西肉瘤发生密切相关。进一步研究发现，胃肠型HIV卡波西肉瘤组织中ORF42、mTORC1 mRNA与VEGF、IL-6 mRNA表达水平均呈正相关，提示HHV8感染可能通过调控ORF42、mTORC1表达，促进VEGF、IL-6等细胞因子水平上调，进而影响卡波西肉瘤发生发展。

综上所述，胃肠型HIV卡波西肉瘤组织中HHV8感染率增加，可能通过激活ORF42、mTORC1表达促进肿瘤发生发展。但HHV8感染与胃肠型HIV卡波西肉瘤组织ORF42、mTORC1之间的具体作用机制还需进一步通过细胞及动物实验验证。