五味子乙素下调IGFBP2表达抑制吉非替尼耐药肺癌细胞增殖

孙蕾，蓝秀，吕祝庆，李伟文

温州医科大学附属第五医院 呼吸内科，浙江 丽水 323000

肺癌是世界范围内发病率和病死率最高的恶性肿瘤，严重威胁人类健康，其中，非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是最常见的恶性肿瘤，占肺癌的85%以上，大部分患者确诊时已为晚期，治疗效果不佳，5年生存率仅为17.1%[1]。吉非替尼（gefitinib，Gef）的应用显著延长了患者无进展期和生存期，但极易耐药[2]。五味子乙素（Schisandrin B，Sch B）是一种具有广谱抗癌作用的中药单体[3]，不仅能够诱导肿瘤细胞凋亡、抑制细胞增殖[4]，还能抵抗多种抗肿瘤药物（如多西他赛、阿霉素）的耐药性[5-7]。然而，Sch B能够缓解吉非替尼耐药的作用及其机制仍未明确。胰岛素样生长因子结合蛋白2（insulin-like growth factor binding protein 2，IGFBP2）在肺癌组织中呈高表达，与肿瘤细胞的增殖、迁移、转化等恶性生物行为密切相关[8]。也有研究报道IGFBP2与埃罗替尼、达沙替尼等药耐药有关[9]，IGFBP2 可能是缓解吉非替尼耐药的关键靶点。因此，本研究观察Sch B对Gef耐药的PC9（PC9/GR）细胞增殖、凋亡的影响，并探讨IGFBP2在Sch B抑制PC9/GR细胞增殖中的作用。

1 材料和方法

1.1 试剂 Sch B（＞98%，相对分子质量：400.4648， 货号：S117968）购自美国阿拉丁公司，杜尔伯科改良伊格尔培养基（DMEM，货号：11965118）、青霉素-链霉素双抗（货号：15140148）、胎牛血清（FBS，货号：10091155）、胰蛋白酶（货号：25300054）购自美国Gibco公司，3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT，货号：M5655）、二甲亚砜（货号：D2650）购自美国Sigma公司；IGFBP2（货号：3922）、p-AKT（货号：4060）、AKT（货号：4685）、p-mTORC1（货号：5536）、mTORC1（货号：2587）和β-actin（货号：4970）单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.2 细胞培养与驯化 将人肺癌PC9细胞（ATCC细胞库）培养种植于含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM，取对数生长期细胞进行实验。采用浓度递增法构建Gef耐药的细胞，使PC9能在含有200 nmol/L的Gef培养基中稳定存活，建立PC9获得性耐药细胞（PC9/GR）。

1.3 细胞转染 按2×105个PC9/GR细胞接种于6孔培养板。用无双抗、无血清培养基，置于饱和湿度、37 ℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞融合至40%～50%时进行病毒感染。按照说明书方法，取 10 μL的IGFBP2 过表达腺病毒载体和阴性腺病毒载体原液，逐步浓度稀释为10-7PFU/mL，按每孔 1 000 μL稀释液加入细胞中，继续培养8～12 h后观察细胞状态。在转染后12、24、48 h观察细胞转染情况，获得IGFBP2 过表达组和阴性载体组的 PC9/GR细胞，并用Western blot进行验证。

1.4 细胞分组 将细胞分为PC9组、PC9/GR组，Sch B组、阴性载体组、IGFBP2过表达组、阴性载体+ Sch B组、IGFBP2过表达+Sch B组处理；Sch B组为用25、50、100 μmol/L Sch B处理的PC9/GR细胞，阴性载体组为阴性腺病毒载体转染的PC9/GR细胞，IGFBP2过表达组为IGFBP2过表达腺病毒载体转染的PC9/GR细胞，阴性载体组+Sch B组为阴性腺病毒载体转染的PC9/GR细胞，并用50 μmol/L Sch B处理，IGFPB2过表达+Sch B组为IGFBP2过表达腺病毒载体转染PC9/GR细胞，并用50 μmol/L Sch B处理，PC9/GR组为PC9/GR细胞，PC9组为未驯化耐药的PC9细胞。

1.5 细胞存活实验 将2×105个PC9/GR细胞接种于96孔板中，按PC9组、PC9/GR组，Sch B组、阴性载体+Sch B组、IGFBP2过表达+Sch B组处理，并继续培养48 h后，每孔加入20 μL MTT，37 ℃下孵育4 h。弃去上清液，加入二甲亚砜120 μL终止反应。酶标仪中检测各孔的吸光度值，计算细胞存活率。

1.6 细胞凋亡检测 将2×106个PC9/GR细胞接种于6 孔板中，按Sch B组、阴性载体+Sch B组、IGFBP2过表达+Sch B组处理，并继续培养48 h后，收集细胞，加入1 mL PBS洗涤3次，再加入196 μL Binding buffer，并依次加入5 μL Annexin VFITC、10 μL PI，室温下避光孵育15 min，用流式细胞仪检测。

1.7 Western blot检测 用预冷PBS漂洗3次后，加入150 μL RIPA细胞裂解液，冰上裂解15 min，收集细胞裂解液，置于4 ℃离心机，12 000 r/min离心15 min，取上清液。取20 μg总蛋白用聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳分离，转至PVDF膜；经3%脱脂奶粉封闭1 h，加入适量比例的抗IGFBP2、p-AKT、AKT、p-mTORC1、mTORC1一抗，置于4 ℃冰箱过夜。用PBST缓冲液洗膜后，按1:10 000～1:20 000加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温下孵育2 h。洗膜后，用增强化学发光法显影，Image J统计条带的灰度值。

1.8 RT-PCR检测 总RNA用TRIzol试剂（美国 Invitrogen公司）抽提，即加入1 mL TRIzol试剂吹下细胞，加入200 μL氯仿，EP管内静置15 min后，置于4 ℃离心机，12 000 r/min离心15 min。取上清液，用1 mL 75%乙醇洗涤，再次离心，弃上清液、干燥后取RNA沉淀物。按照PrimeScript RT Master Mix（大连Takara公司）说明书合成cDNA。将反转录物用SYBR Premix Ex TaqTMII试剂盒（大连Takara公司）在ABI 7500 PCR仪上进行real time-PCR扩增、检测。使用GAPDH作为内参照，引物系列如下：IGFBP2上游5’-GCCCTCTGGAGCACCTCTACT-3’，下游5’-CATCTTGCACTGTTTGAGGTTGTAC-3’；GAPDH：上游5’-CT CCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3’，下游5’-CCCAATACGACCAA ATCCGTT-3’；采用ΔΔCt法分析IGFBP2 mRNA的表达量。

1.9 统计学处理方法 采用SPSS22.0统计软件分析。计量资料以表示，2组间比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PC9与PC9/GR细胞存活和IGFBP2 表达差异 200 nmol/L的Gef处理条件下，PC9/GR组存活率无明显下降，PC9组存活率显著降低（见图1A）；与PC9组比较，PC9/GR组IGFBP2的mRNA和蛋白表达明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05，见图1B-D）。

2.2 Sch B对PC9/GR细胞增殖、凋亡的影响 与PC9/GR组相比，25、50、100 μmol/L Sch B处理的PC9/GR细胞存活率明显下降（见图2A），细胞凋亡比例明显增加（见图2B），差异有统计学意义（P＜0.05）；且吸光度值下降率约50%时，Sch B的浓度为50 μmol/L，该浓度用于后续实验。

2.3 Sch B对PC9/GR细胞IGFBP2、AKT、mTORC1的影响 与PC9/GR组相比，25、50、100 μmol/L Sch B 处理的PC9/GR细胞IGFBP2、p-AKT、p-mTORC1明显下降（见图3），差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 IGFBP2过表达减弱Sch B诱导的PC9/GR细胞增殖抑制作用 与阴性载体组相比，IGFBP2 过表达组IGFBP2、p-AKT、p-mTORC1明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；与阴性载体+Sch B组相比，IGFBP2过表达+Sch B组细胞存活增加，细胞凋亡降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图4。

3 讨论

图1 PC9与PC9/GR细胞存活和IGFBP2表达情况

图2 Sch B抑制PC9/GR细胞增殖促进凋亡

图3 Sch B抑制PC9/GR细胞IGFBP2、AKT、mTORC1的表达

图4 IGFBP2过表达对Sch B诱导PC9/GR细胞增殖抑制和凋亡作用的影响

Gef属于第一代酪氨酸激酶抑制剂，靶向抑制EGFR分子生物学功能，显著提高EGFR突变肺癌患者的临床疗效。然而，大部分患者接受Gef治疗后极易发生耐药，其机制包括：T790M突变、旁路信号通路、EGFR下游信号通路等[10]。胰岛素样生长受体1（IGF receptor 1，IGFR1）介导的信号通路被认为是EGFR受体抑制剂耐药的关键通路。IGFR1通过激活PI3K/AKT信号通路，促使细胞逃避Gef的杀伤作用，且IGFR1受体抑制剂能显著提高Gef的疗效[11]。IGFBP2是胰岛素样生长因子结合蛋白家族主要成员之一，通过激活多条信号通路，如PI3K/AKT、ERKMAPK信号通路，参与肺癌细胞增殖、迁移、耐药，介导肿瘤复发和转移。研究表明IGFBP2通过增加肿瘤微血管新生来抵抗药物的杀伤作用[12]。IGFBP2激活下游AKT信号通路，促使肺癌细胞对达沙替尼耐药[8]。本研究结果也证实，与非耐药细胞相比，Gef耐药细胞内IGFBP2蛋白和mRNA表达量均明显增加，说明了IGFBP2高表达可能是PC9细胞对Gef耐药的关键分子。

Sch B是五味子的主要活性成分之一，具有化疗增敏、缓解肿瘤耐药的作用。YAN等[5]证实Sch B显著增加多西他赛的抗肿瘤敏感性。HUANG等[6]证实Sch B能够逆转P-糖蛋白介导阿霉素耐药作用。WANG等[7]证实Sch B抑制P-糖蛋白和促进蛋白酶体介导的survivin降解逆转阿霉素耐药性。本研究 中，Sch B处理后，PC9/GR细胞存活率明显下降、细胞凋亡比例明显升高，IGFBP2、AKT、mTORC1的磷酸化水平明显下降，说明Sch B具有抑制Gef耐药细胞增殖、下调IGFBP2、抑制AMT/mTORC1通路的作用。进一步研究发现，过表达IGFBP2 腺病毒显著抵抗SchB对PC9/GR细胞增殖抑制作用。

综上所述，本研究体外证实了获得性Gef耐药的PC9/GR细胞中IGFBP2表达增高，Sch B通过下调IGFBP2、抑制AKT/mTORC1，抑制PC9/GR细胞增殖。然而仍需在体内进一步研究Sch B对PC9/GR细胞耐药的影响，为研发抗吉非替尼耐药的新型药物提供科学根据。