槲皮素对人鼻咽癌细胞生长和AKT/mTOR通路表达的影响

张佳凤，赵辉，何平，郝亚琳，董琼娜，金晓杰

上海交通大学医学院附属仁济医院 耳鼻咽喉科，上海 201112

鼻咽癌是头颈部的上皮性恶性肿瘤，在东南亚尤其是华南地区发病率较高[1]。鼻咽癌的标准治疗方法是放疗，同时进行辅助化疗[2-3]。然而，标准治疗只有在早期治疗鼻咽癌时才有效。当疾病发展到晚期时，局部复发和化疗耐药是导致死亡的主要原因[4]。虽然鼻咽癌与人类EBV感染密切相关，但研究发现，环境致癌物、诱导性遗传因素以及AKT/mTOR通路等的异常激活，都会影响鼻咽癌的转化和发展[5]。因此，针对这些重要通路的治疗策略将有利于更好地开展鼻咽癌的临床治疗。

槲皮素是一种植物性黄酮苷类化合物，被用作营养补充剂，并可预防癌症等各种疾病的发生[6]。越来越多的研究揭示了槲皮素的生物和药理活性，且发现其可选择性抑制癌细胞增殖，发挥促进细胞凋亡作用[7]。槲皮素可抑制膀胱癌、乳腺癌、结肠癌等多种癌细胞增殖和迁移，发挥抑癌作用[8]。多项研究也在细胞水平发现，槲皮素可抑制鼻咽癌细胞增殖，诱导凋亡[9-10]。尽管已通过体外细胞实验发现槲皮素可抑制鼻咽癌细胞增殖，但其具体的分子作用机制尚不清楚。本研究拟通过细胞实验和动物实验，探索槲皮素对鼻咽癌5-8F细胞增殖的影响，并进一步用荧光定量PCR和Western blot检测槲皮素对鼻咽癌细胞中AKT/mTOR通路的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 药物与试剂：DMEM培养液和胎牛血清购自美国Gibco公司；槲皮素、胰蛋白酶、青链霉素购自美国Sigma公司；BCA法蛋白浓度检测试剂盒购自广州鼎国生物公司，TRIzol购自美国Life公司，反转录试剂盒与荧光定量PCR检测试剂盒购自大连宝生物公司。AKT和mTOR基因引物均由生工生物工程（上海)股份有限公司设计合成。MTT和实验中所使用抗体（AKT多克隆抗体、mTOR多克隆抗体、β-actin单克隆抗体和辣根过氧化物标记的二抗）以及RIPA蛋白裂解液均购自上海碧云天生物技术公司。

1.1.2 细胞与动物：人鼻咽癌5-8F细胞由中科院上海细胞库提供，培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37 ℃、含5%的CO2并且湿度完全饱和的恒温培养箱中培养，定期对细胞进行传代。6周龄左右且体质量（25±2）g的雌性BALB/c小鼠10只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。动物许可证号为SCXK（京)2016-0011。

1.2 方法

1.2.1 制备小鼠移植瘤模型：将对数期5-8F细胞浓度调整至5×107/mL，取0.3 mL细胞悬液在每只小鼠右后侧肢体腋下行皮下注射，连续观察1周后以腋下肿瘤结节形成且质地较硬为成瘤标准。

1.2.2 MTT实验：将100 μL对数生长期的5-8F细胞（1×105/孔）接种于96 孔板中，每组设置4 个复孔，共3组，加入不同浓度的槲皮素（20、40和 60 μmol/L）处理24 h、48 h和72 h后，MTT处理 4 h，使用分光光度计检测吸光度，记下数值，细胞生长抑制率=（1-加药组A570/空白组A570）×100%。

1.2.3 药物处理和肿瘤大小观察：成瘤小鼠随机分为对照组和槲皮素组，每组5只。槲皮素组裸鼠腹腔注射25 mg/kg槲皮素，3次/周，每次0.2 mL，共4周，对照组腹腔注射等体积0.9%氯化钠溶液，3次/周，共4周。每周用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，肿瘤体积=（长径×短径2）/2。给药4周后，颈椎脱臼法处死裸鼠，取肿瘤组织保存在液氮中。

1.2.4 荧光定量PCR：使用TRIzol试剂分离细胞RNA，测定浓度后采用反转录PCR实验获得cDNA。然后通过实时定量PCR实验，以GAPDH作为对照，采用2-ΔΔCt法计算AKT和mTOR基因mRNA含量。

1.2.5 Western blot：用预冷的细胞裂解液裂解细胞15 min，4 ℃下12 000 r/min离心5 min，收取蛋白。肿瘤组织先在研钵中加入液氮进行研磨，在研磨充分后加入细胞裂解液，离心后获得肿瘤组织蛋白，所获得蛋白经BCA比色法计算蛋白浓度。通过SDS-PAGE电泳将蛋白进行分离后先后使用一抗和二抗进行孵育，然后进行条带的扫描。

1.2.6 免疫组织化学法：脱蜡及水化后的石蜡切片经1%的Triton X-100处理15 min，再用3%的H2O2处理10 min，随后加入AKT和mTOR抗体孵育，置于湿盒4 ℃过夜。第2天清洗后孵育对应的二抗，室温下30 min。最后进行染色封片。染色结果采用DAB显色法进行观察，使用苏木精进行对比染色。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS17.0软件进行统计分析，计量资料采用表示，2组间比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验，重复测量资料采用重复测量资料的方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度槲皮素对鼻咽癌5-8F细胞增殖的影响 20、40、60 μmol/L槲皮素处理24、48和72 h均可显著抑制5-8F细胞增殖，且槲皮素浓度越高，对细胞的抑制率越高（P＜0.05）。槲皮素抑制5-8F细胞增殖的作用呈浓度依赖性和时间依赖性。见 表1。

表1 槲皮素处理后鼻咽癌5-8F细胞的生长抑制率（%）

2.2 槲皮素对5-8F细胞中AKT/mTOR通路表达的影响 5-8F细胞经不同浓度槲皮素（20、40、 60 μmol/L）处理48 h后，随着槲皮素浓度增加，AKT和mTOR的mRNA水平显著降低（P＜0.05），见图1。Western blot检测细胞中AKT和mTOR的蛋白表达水平发现，在相同的处理时间内（48 h），槲皮素浓度升高，AKT和mTOR的蛋白表达水平降低（P＜0.05），见图2。

图1 5-8F细胞经槲皮素处理后AKT和mTOR的mRNA水平

2.3 槲皮素对体内肿瘤生长的影响 所有裸鼠注射5-8F细胞1周后，进食及活动情况未见明显变化，肿瘤表面皮肤无破溃发生。每周对裸鼠的体质量和肿瘤体积进行监测，结果显示裸鼠的体质量之间差异无统计学意义（P＞0.05）；与对照组相比，槲皮素处理组的肿瘤体积在第21天和第28天明显受抑制 （P＜0.05），见图3。

2.4 槲皮素抑制AKT和mTOR在体内表达 Western blot结果显示，槲皮素处理组中，AKT和mTOR蛋白水平显著降低，与对照组比差异有统计学意义（P＜0.05），见图4。免疫组织化学法结果显示，槲皮素处理组AKT和mTOR蛋白水平显著低于对照组，见图5。

3 讨论

鼻咽癌是一种发生于鼻咽黏膜上皮细胞的恶性肿瘤，具有易复发、易早期转移及恶性程度高等特点，是我国南方地区常见头颈部的恶性肿瘤[1-2]。目前，放疗联合化疗仍是治疗鼻咽癌的主要手段，其控制率可达80%以上[11]。然而，放疗后的复发与远处转移是临床治疗中面临的两大难题[12]。因此，寻求药效强和不良反应小的抗肿瘤药物是目前鼻咽癌临床治疗中急需解决的问题。

图2 槲皮素对5-8F细胞中AKT和mTOR蛋白表达水平的影响

图3 不同处理方式对裸鼠肿瘤生长的影响

图4 Western blot检测不同处理组裸鼠肿瘤组织AKT和mTOR蛋白水平

近年来，随着中医药产业蓬勃发展，筛选与挖掘活性天然产物已成为抗肿瘤药物开发的重要来 源[13]。来源于中药地榆的地榆皂苷对肝癌、乳腺 癌、人甲状腺乳头状癌等多种肿瘤均表现出明显的抗肿瘤药效[14]。ZHU等[15]研究发现，地榆皂苷可激活乳腺癌细胞内的ROS/JNK信号通路，进而加速乳腺癌细胞的凋亡。

槲皮素是一种天然的黄酮醇类化合物，广泛存在于水果、蔬菜及中草药中，具有显著的抗炎、抗肿瘤及清除自由基等功效[6]。大量研究表明，槲皮素可调节细胞内外AMPK途径、PI3K-AKT途径和mTOR等多个信号通路，进而影响肿瘤细胞的生长[16-17]。SU等[18]研究表明，槲皮素可通过AMPK信号通路激活诱导膀胱癌细胞凋亡。WARD等[19]研究结果也表明槲皮素可通过衰减细胞存活和抑制抗凋亡途径抑制前列腺癌的发展。已有多项研究发现，槲皮素也可通过抑制鼻咽癌CNE2细胞或HEN1细胞增殖从而诱导细胞凋亡，其诱导细胞凋亡的作用机制可能是通过下调Bcl-2 蛋白的表达，或将细胞周期阻滞于G2/M期和诱发胱天蛋白酶依赖的细胞凋亡[9-10]。本研究通过细胞实验也发现槲皮素可显著抑制鼻咽癌5-8F细胞增殖，其抑制率与槲皮素浓度呈现正相关性，且通过裸鼠移植瘤模型实验进一步证实，槲皮素对裸鼠鼻咽癌肿瘤体积有明显的抑制作用。上述体内外实验表明，槲皮素可能是治疗鼻咽癌重要的潜在药物。

图5 免疫组织化学法检测不同处理组裸鼠肿瘤组织AKT和mTOR蛋白水平

AKT/mTOR信号通路是细胞内信号转导的重要途径之一，其与细胞的代谢、增殖、分化和凋亡等生理过程紧密相关[20]。AKT是AKT/mTOR信号通路中的一个重要激酶，可磷酸化p70S6K和4EBP1，而p70S6K和4EBP1是AKT/mTOR信号通路下游的主要靶点，可调控蛋白合成和细胞周期进程。近年来，大量研究已证实，AKT/mTOR信号通路在各类肿瘤的发病与治疗中发挥了重要的作用。特别是与黄酮类物质的抗肿瘤药效作用发挥密切相关。JIA等[21]研究发现槲皮素通过Akt/mTOR途径抑制乳腺癌糖酵解与迁移，从而抑制乳腺癌的发展。此外，GRANATO 等[22]研究也表明槲皮素可通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导原发性积液性淋巴瘤细胞凋亡和自噬。WANG等[23]报道了AKT/mTOR信号通路的激活与鼻咽癌患者不良预后有关，而AKT/mTOR信号通路参与鼻咽癌细胞增殖、上皮间质转化、自噬、凋亡等过程[24-25]。本研究体内外实验均证实，槲皮素能显著抑制AKT/mTOR信号通路中AKT和mTOR的mRNA和蛋白表达水平。进一步分析发现，上述蛋白转录与翻译水平与鼻咽癌的增殖水平密切相关。这表明，槲皮素可能通过调节AKT/mTOR信号通路进而抑制鼻咽癌的发展，但具体的调控机制有待进一步研究。

综上，本研究初步探索了槲皮素抑制鼻咽癌细胞增殖的分子机制，相关结果为活性天然产物开发提供了基础。