龟板联合阿伦磷酸钠预防糖皮质激素性骨质疏松症的实验研究

周国新,江帝钦,张史飞,温干军

(东莞市东部中心医院，广东 东莞 523573)

糖皮质激素具有抗炎及免疫抑制作用，已广泛应用于临床各科，但其应用带来的不良反应如胰岛素抵抗、高血压、青光眼和骨质疏松症等仍不可忽视。糖皮质激素性骨质疏松症(GIOP)是临床应用糖皮质激素最严重的并发症之一[1]，生理剂量的糖皮质激素就可引起骨量丢失，使骨质疏松骨折的发生率大大增加[2]，而长期超生理剂量糖皮质激素的使用，10%的患者诊断为临床骨折，30%～40%的患者影像学证据显示椎骨骨折，并且髋部及非椎骨骨折的风险也增加(相对危险度分别为1.6和1.3)[3-5]。骨质疏松骨折的发生严重影响患者生活质量，加重家庭及社会的负担，如何有效地预防GIOP的发生发展是目前亟待解决的重要问题。口服双磷酸盐类药物(阿伦磷酸钠与利塞膦酸钠)是目前临床推荐的治疗GIOP的一线药物，但双磷酸盐类药物存在上消化道反应、急性期发热反应、骨骼肌肉疼痛及下颌骨坏死等不良反应[6]，严重影响了患者的依从性及临床疗效。中医药可有效改善GIOP患者主要临床症状，提高骨密度，改善骨代谢，为临床防治GIOP提供了新的思路[7]。中医提倡“治未病”的理念，注重未病先防，即在疾病未发生之前给予干预以预防其发生。基于此，本研究观察了中药龟板与阿伦磷酸钠联合应用与各自单用对GIOP的预防作用，旨在探讨中西药联合应用的价值。

1 实验材料与方法

1.1药物、试剂与仪器 地塞米松磷酸钠注射液(天津遂成药业，规格：1 mL∶2 mg)；龟板(将100 g龟板饮片置于适量纯水中浸泡过夜，文火煎煮2 h，煎煮成50 mL，生药浓度为2 g/mL)；阿伦磷酸钠(默沙东，规格：70 mg /片，置于研钵内研磨后水溶解，现磨现用)。双能X射线 (DEXA)骨密度仪(美国GE公司)；Micro-CT 仪(viva CT40，SCANCO Medical AG)；万能材料试验机(美国Instron公司)。

1.2实验动物 SPF级SD雌性大鼠36只，3月龄，体重220～250 g，由中国人民解放军南部战区总医院动物实验中心提供，合格证号：44002100011623。分笼饲养，自由摄食饮水，室温控制在23～25 ℃，湿度67%，通风良好，适应性饲养1周后进入实验阶段。

1.3实验方法 将36只大鼠随机分为基础组、对照组、模型组、龟板组、阿伦磷酸钠组、联合组，每组6只。基础组在实验开始称量体重后即处死取材，模型组、龟板组、阿伦磷酸钠组、联合组参考文献[8]方法建立GIOP模型，即大鼠肌肉注射地塞米松注射液1.0 mg/kg，对照组给予等体积生理盐水肌肉注射，均1次/3 d，连续5周。自造模开始，按照人与大鼠体表面积折算法换算给药量，龟板组同时给予龟板溶液3.15 g/(kg·d)灌胃；阿伦磷酸钠组每周第1天给予阿伦磷酸钠水溶液7.35 mg/kg 灌胃，其余6 d给予等体积生理盐水灌胃；联合组每周第1天给予阿伦磷酸钠水溶液7.35 mg/kg 灌胃，其余6 d给予龟板溶液3.15 g/(kg·d)灌胃；对照组与模型组每天给予等体积生理盐水灌胃。每周于清晨空腹状态称量及记录大鼠体重，并根据体重变化适当调整给药剂量。

1.4观察指标及方法

1.4.1骨密度检测 灌胃结束后，用10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉各组大鼠，由同一操作者运用双能X射线骨密度测量仪检测全身骨密度，使用仪器自带的小动物专用分析软件分析大鼠全身骨矿盐含量、骨面积、骨密度。

1.4.2腰椎Micro-CT扫描 大鼠处死后分离第4腰椎，并彻底剔除软组织，检测前将第4腰椎放入生理盐水中浸泡24 h后进行 Micro-CT扫描，设置扫描厚度为15 μm，设置感兴趣区域为椎体内直径2 mm的圆形范围区域，获取感兴趣区域骨微细结构参数，包括骨面积体积比(BS/TV)、相对骨体积(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁间距(Tb.Sp)、骨小梁模式因子(Tb.Pf)、结构模型指数(SMI)。

1.4.3腰椎骨生物力学检测 用磨砂纸将第4腰椎处理为两端平行、约5 mm高度的中心圆柱体，用万能材料试验机进行压缩试验，压缩速度设置为1 mm/min。分析最大载荷、压缩位移、压缩刚度及能量吸收值。

2 结 果

2.1各组大鼠全身骨密度比较 模型组大鼠全身骨矿盐含量、骨面积、骨密度均明显低于基础组(P均<0.05)。与对照组比较，龟板组、阿伦磷酸钠组及联合组大鼠全身骨矿盐含量、骨面积、骨密度均升高，其中阿伦磷酸钠组及联合组均显著高于对照组(P均<0.05)；与模型组比较，龟板组、阿伦磷酸钠组及联合组大鼠全身骨矿盐含量、骨面积、骨密度及对照组大鼠全身骨矿盐含量、骨密度均明显升高(P均<0.05)；阿伦磷酸钠组及联合组大鼠全身骨矿盐含量、骨面积、骨密度均明显高于龟板组(P均<0.05)，联合组大鼠全身骨矿盐含量、骨密度均明显高于阿伦磷酸钠组(P均<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠全身骨矿盐含量、骨面积、骨密度比较

2.2各组大鼠腰椎骨微结构参数比较 与对照组比较，龟板组、阿伦磷酸钠组及联合组大鼠Tb.Th均明显升高(P均<0.05)，SMI均明显降低(P均<0.05)；与模型组比较，对照组、龟板组、阿伦磷酸钠组及联合组大鼠BS/TV、BV/TV、Tb.N(龟板组除外)、Tb.Th均明显增高(P均<0.05)，Tb.Sp、Tb.Pf、SMI均明显降低(P均<0.05)； 联合组大鼠SMI明显低于龟板组及阿伦磷酸钠组(P均<0.05)。见表2。

2.3各组大鼠腰椎骨微结构三维重建图像 Micro-CT扫描重建图像显示：与对照组比较，模型组大鼠松质骨出现明显骨量丢失，骨小梁稀疏、细小，排列不均，网状结构破坏，出现大片无骨小梁骨髓区，出现明显的骨微结构破坏；各药物干预组较模型组骨小梁增粗，结构紧密，排列连续均匀，骨质明显改善。见图1。

2.4各组大鼠腰椎骨生物力学比较 与对照组比较，模型组大鼠最大载荷、压缩位移、压缩刚度均明显降低(P均<0.05)，2组能量吸收值比较差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，龟板组、阿伦磷酸钠组及联合组大鼠最大载荷、压缩位移、压缩刚度及能量吸收值均明显增高(P均<0.05)；联合组大鼠最大载荷明显高于龟板组和阿伦磷酸钠组(P均<0.05)。见表3。

表2 各组大鼠腰椎骨微细结构参数比较

图1 各组大鼠腰椎横截面三维重建图像

表3 各组大鼠腰椎骨生物力学参数比较

3 讨 论

根据GIOP的临床表现，中医将其归为“骨痿”“骨痹”“腰痛”范畴。糖皮质激素作为一种外源性的药物，对机体来说属于“药邪”，属大辛大热之物[9]，易耗伤肾阴，阴损及阳，导致肾中阴阳平衡失调，最终影响骨髓化生，骨骼失去肾精的濡养而发为骨痿。《素问·痿论》曰：“肾气热，腰脊不举，骨枯而髓减，发为骨痿。”《丹溪心法》指出：“肾虚受之，腿膝枯细，骨节酸疼，精走髓空。”指出了GIOP的基本病机为肾虚精亏，骨失所养。因此，GIOP的治疗以补肾填精为主。龟板是传统的名贵中药，有滋阴补肾、滋阴潜阳、补血止血、益肾健骨等功效。《本草蒙筌》指出龟板“专补阴衰，善滋肾损”。《本草纲目》言龟板“能治疗腰膝酸软”。现代药理研究也证实龟板具有抗骨质疏松的作用[10]，但临床上很少用单味中药防治GIOP，故本研究将龟板与GIOP的一线用药阿伦磷酸钠联合应用，研究中西药联合对GIOP的预防作用。

GIOP作为最常见的继发性骨质疏松症类型，骨折是其最严重的并发症，骨密度的降低及骨折风险的增加与糖皮质激素的使用时间及剂量相关，使用时间越长，剂量越大，则骨折发生风险越高[11]。以往有研究报道，龟板联合阿伦磷酸钠对GIOP大鼠的骨密度及骨代谢有明显的改善作用，但其主要是研究龟板联合阿伦磷酸钠对GIOP大鼠的治疗作用，是在造模成功的基础上进行的治疗性干预[12]。《素问·四气调神大论》指出：“不治已病治未病，不治已乱治未乱。”中医“治未病”理念包括未病先防和既病防变两个方面。未病先防，即在中医理论的指导下根据病因病机预测疾病的转归，进行早期干预，以预防疾病的发生发展。正如《金匮要略》所说的“见肝之病，知肝传脾，当先实脾”。有研究提倡在开始使用糖皮质激素的早期即进行预防性治疗，以降低骨折的发生率[2]。基于此，本研究在GIOP造模的同时给予了中西药物预防性干预，观察早期预防对GIOP大鼠骨密度、骨微结构、骨生物力学的影响。

骨密度是诊断骨质疏松症的金标准，可反映骨骼的矿物质水平。本研究设置了基础组作为基线对照，经过造模后模型组大鼠全身骨密度显著低于基础组，说明GIOP大鼠造模成功。不同药物预防性干预后，各组大鼠骨密度均有提高，联合组大鼠提高最为明显，说明龟板与阿伦磷酸钠联合用药的效果优于单一药物干预。大量研究表明单纯骨密度检测不能准确反映器官和组织水平的结构特性信息[13]。Micro-CT技术是分析骨骼骨矿含量及重塑骨骼微细结构的敏感且可靠的定量定性分析技术[14]，李捷等[15]采用该技术观察了阿伦磷酸钠早期干预对GIOP大鼠股骨远端松质骨超微结构的影响，发现阿伦磷酸钠可有效改善股骨微结构，有对抗糖皮质激素性骨质疏松的作用。故本研究采用Micro-CT技术对大鼠腰椎骨进行分析。结果显示，与模型组比较，对照组、龟板组、阿伦磷酸钠组及联合组BS/TV、BV/TV、Tb.N、Tb.Th明显升高，Tb.Sp、Tb.Pf、SMI明显降低，联合组较龟板组与阿伦磷酸钠组变化更为明显，联合组骨小梁数量增多、排列结构整齐，骨质改善更为明显。说明龟板联合阿伦磷酸钠不仅可提高GIOP大鼠的骨密度，还可以改善其腰椎骨微细结构，对骨量及骨质量均有改善作用，可有效预防GIOP的发生。

骨量与骨质量是影响骨强度的因素，但骨量不等于骨骼的强度,强度需要从整体上评估力学性能，骨量、骨质量、骨强度三者联合使用是评估骨骼的结构与强度的硬指标。本研究采用腰椎压缩试验对腰椎的生物力学性能进行分析，发现与模型组比较，龟板组、阿伦磷酸钠组及联合组最大载荷、压缩位移、压缩刚度及能量吸收值均明显增高，联合组大鼠最大载荷明显高于龟板组和阿伦磷酸钠组，且压缩位移、压缩刚度及能量吸收值较龟板组和阿伦磷酸钠组有增大趋势。说明龟板与阿伦磷酸钠联合应用可改善GIOP大鼠腰椎的生物力学性能，可提高骨强度。国内有研究表明，单一使用龟板或阿伦磷酸钠都可改善GIOP大鼠腰椎的生物力学性能[16]，与本研究结果相一致。

总之，龟板联合阿伦磷酸钠可提高GIOP大鼠骨密度，改善骨微结构，增加骨强度，对GIOP有预防性治疗作用，两种药物联合使用有协同增效作用。但关于龟板与阿伦磷酸钠联合用药预防GIOP的相关作用机制还有待于进一步研究。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。