龙胆苦苷对溃疡性压疮模型大鼠创面愈合的影响

李 强，卢 娟，郭洪章，李建国，刘军刚，杨晨旭

(1. 甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050；2. 暨南大学，广东 广州 510000)

溃疡性压疮是长期卧床或骨折患者皮肤易出现的最严重并发症，深度溃疡期可累及肌肉、筋膜甚至骨骼，具有难敛、难愈、病程长、易复发等临床特点，国家中医药管理局认定该病为外科疑难病症，亦为国际上面临的医学难题。如治疗不及时，可导致肉腐骨露并感染，并发症及病死率较高[1-2]。现代医学对溃疡性压疮尚无统一有效的治疗方案，既往研究表明中药外用可促进慢性溃疡愈合[3]。养阴生肌散为甘肃省中医院院内制剂，已临床应用30多年，在治疗溃疡性疾病方面疗效显著[4-5]。养阴生肌散为中药复方制剂，其中龙胆草为君药，具有收敛生肌、消炎止痛的功效。前期高效液相色谱分析结果表明，龙胆苦苷是养阴生肌散的主要成分[5]，可能在养阴生肌方面起主要作用。相关实验研究报道，龙胆苦苷具有很好的抗炎、消肿止痛作用[6-9]。然而龙胆苦苷单体在治疗溃疡性压疮方面的研究尚未见报道，故本课题组进行了相关研究，现将结果报道如下。

1 实验材料方法

1.1实验动物 SPF级雄性SD大鼠48只，体重(250±20)g，饲养于甘肃中医药大学动物实验中心，动物许可证号:SCXK(甘)2011-0001，实验动物设施证号:SYXK(甘)2011-0001。 动物饲养于标准条件：室温18～22 ℃，湿度40%～60%，自由饮食。

1.2药物 养阴生肌散(龙胆草、雄黄、牛黄、青黛、冰片等组成)由甘肃省中医院药剂科提供(甘药制字Z04000835)。龙胆苦苷分析纯购于四川省禾益康生物科技有限公司(CAS号：20831-76-9)。

1.3试剂与仪器 抗增殖细胞核抗原(PCNA)单克隆抗体(英国Abcam公司)；Mayer’s苏木素染液(北京索莱宝科技有限公司)；免疫组化笔(北京中杉金桥生物科技有限公司)；免疫组化试剂盒(博士德生物工程有限公司)；PCR引物(天一辉远生物科技有限公司)；qRT-PCR试剂盒(大连TaKaRa生物技术有限公司)；实时定量Agilent PCR仪(美国安捷伦科技公司)；组织石蜡切片机(LEICA公司)；KD-BMII型组织包埋机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)；PHY-III型组织漂烘机(常州市中威电子仪器有限公司)；高速离心机(湖南省长沙市康湘英离心机有限公司)；通用器械(上海医疗器械有限公司)。

1.4实验方法 雄性SD大鼠适应性喂养3 d后，随机分为正常对照组、模型组、养阴生肌散组及12.5 mg龙胆苦苷组、25 mg龙胆苦苷组、50 mg龙胆苦苷组，每组8只。除正常对照组外，其余各组大鼠参照文献[6]方法造模，即在10%水合氯醛 (300 mg/kg) 腹腔注射麻醉后，使大鼠仰卧固定于大鼠固定板上，用一重量为0.56 kg的钢柱垂直施压于大鼠左后肢，主要受压的肌肉为股内收肌和耻骨肌，钢柱和肢体的接触面积为直径1 cm的圆形表面，受压部位单位面积承受的压力为70 kPa，施压5 h。正常对照组大鼠麻醉后仰卧固定于固定板上5 h。造模后解除固定，常规单只分笼饲养[10]，养阴生肌散组大鼠压疮部位均匀撒敷50 mg养阴生肌散药粉，龙胆苦苷各组大鼠撒敷相应剂量龙胆苦苷药粉，模型组大鼠清创后用安尔碘消毒剂涂擦创面，均2次/d，无菌敷料纱布遮盖，干预15 d。

1.5观察指标及方法

1.5.1创面面积、愈合率及愈合时间 分别在干预3 d、7 d、11 d、15 d后，采用最小刻度为0.5 mm皮尺测量受压骨骼肌创面面积；观察各组干预15 d后创面愈合率，统计各组创面愈合时间。创面愈合率=(创面原始面积-创面未愈面积)/创面原始面积×100%。

1.5.2病理形态学 干预15 d后，麻醉下处死各组大鼠并取出创面骨骼肌组织，采用10%福尔马林固定后，石蜡包埋，切片厚度4 μm，进行常规HE染色，在光学高倍显微镜下观察各组织炎性物质浸润情况。

1.5.3骨骼肌组织中PCNA蛋白表达水平 将骨骼肌纤维组织在4%多聚甲醛中固定并用PBS漂洗后，酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切4 μm厚度切片后，严格按照免疫组化操作进行抗原修复、消除内源性过氧化物酶、封闭后抗体孵育、链酶蛋白酶-HRP孵育、DAB显色、苏木素复染、透明封片等处理后，光学显微镜下观察并拍照。使用Nikon图像分析软件分别计算每个切片上组织全貌总面积、染色阳性面积、积分光密度，计算平均灰度值，灰度值=染色阳性面积/组织全貌总面积×积分光密度。

1.5.4骨骼肌组织中 PCNA mRNA表达水平 采用实时荧光定量PCR法检测：将25 mg创面骨骼肌纤维组织参照总RNA提取试剂盒法提取总RNA。Nanodrop仪上测RNA浓度及纯度。检测A260/A280的比值在1.8～2.1，提示RNA质量较好。取2 g RNA反转录成cDNA，引物序列如下：GAPDH上游为5’-GCAAGTTCAACGGCACAG-3’，下游为5’-GCCAGTAGACTCCACGACA-3’；PCNA上游为5’-TTGGCAATGGGAACA-3’，下游为5’-GACAGTGGAGTGGCTTT-3’。然后按两步法进行扩增，用于RT-qPCR的样本量为2 L，反应条件为：95 ℃预变性15 s；95 ℃变性10 s，54 ℃退火60 s，循环次数40次，进行扩增，结果比较用ΔΔCt法。

2 结 果

2.1各时间点创面愈合面积比较 干预3 d、7 d、11 d、15 d后，养阴生肌散组及龙胆苦苷各组创面面积均显著低于同期模型组(P均<0.05)，且50 mg龙胆苦苷组干预15 d后创面面积显著低于同期养阴生肌散组(P<0.05)。见表1。

2.2各组创面愈合率及愈合时间比较 干预15d后，养阴生肌散组及龙胆苦苷各组创面愈合率均显著高于模型组(P均<0.05)，且50 mg龙胆苦苷组创面愈合率显著高于养阴生肌散组(P<0.05)。养阴生肌散组及龙胆苦苷各组创面愈合时间均显著短于模型组(P均<0.05)，且50 mg龙胆苦苷组显著短于养阴生肌散组(P<0.05)。见表2。

表1 各组大鼠干预后不同时间创面面积比较

2.3各组创面骨骼肌纤维组织形态学表现 HE染色显示，正常对照组组织结构清晰；模型组创面组织有大量炎性细胞浸润，组织有水肿，血管有扩张；养阴生肌散组可见零星炎性细胞浸润，部分组织水肿，血管轻微扩张，少量的新生组织；12.5 mg龙胆苦苷组可见较多炎性细胞浸润，组织有水肿，血管有扩张；25 mg龙胆苦苷组可见少量炎性细胞浸润；50 mg龙胆苦苷组可见零星的炎性细胞，无血管扩张，较多新生组织形成。见图1。

表2 各组大鼠干预后创面愈合时间及愈合率比较

2.4各组创面骨骼肌组织中PCNA蛋白及mRNA表达水平 免疫组化结果显示，正常对照组可见骨骼肌细胞，无PCNA阳性细胞；模型组可见少许PCNA阳性细胞，主要散在分布在压疮面及与正常组织交接的边缘；养阴生肌散组可见较多PCNA阳性细胞，分布在创面中央和创面边缘，同时有大量肌细胞增殖；50 mg龙胆苦苷组可见PCNA阳性细胞分布密集，同时伴有肌细胞增生，见图2。养阴生肌散组及龙胆苦苷各组创面骨骼肌组织中PCNA mRNA及蛋白表达水平均显著高于模型组(P均<0.05)，且50 mg龙胆苦苷组增高明显，但与养阴生肌散组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，见表3。

图1 各组大鼠骨骼肌组织HE染色表现(×400)

图2 各组大鼠骨骼肌组织中PCNA蛋白表达情况(×400)

3 讨 论

溃疡性压疮为临床中常见的外科难治性疾病，创面易反复感染并炎性渗出，病情严重者甚至并发败血症或需截肢，严重影响患者的生活质量，给患者带来巨大的心理压力及经济负担[11]。本病属于中医“臁疮”等范畴，《灵枢·痈疽》记载“热胜则肉腐，肉腐则为脓”，其病机以正虚为本，湿热毒侵犯，腐肉生成引发皮肤溃疡[12]。“臁疮”的中医外治首见于汉，古人描述“外科之法, 最重外治”，中医外治法相比较中药内服具有药量小、不良反应少、用法简单及临床疗效好的特点。

表3 各组大鼠骨骼肌组织中PCNA蛋白及mRNA表达水平比较

既往研究表明，龙胆苦苷具有明显的抗炎作用[6-9]。张艳霞等[8]研究表明，龙胆苦苷能够降低关节炎模型大鼠血清中白细胞介素-1β(IL-1β)、环氧合酶-2(COX-2)、前列腺素E2(PGE2)水平。赵文娜等[9]研究发现，龙胆苦苷能够显著降低结肠炎大鼠血清中白细胞介素-8(IL-8)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等炎性因子水平，并随着用药剂量的增加效果越显著；病理学观察发现，龙胆苦苷能显著减少炎性细胞的数量，促进大肠肠黏膜组织的修复。本实验结果显示，龙胆苦苷能够显著促进溃疡性压疮大鼠创面愈合，提高创面愈合率，缩短创面愈合时间，能有效减少炎性细胞数量及促进新生组织形成。

PCNA在细胞核内合成，并存在于细胞核内，为DNA聚合酶δ的辅助蛋白，其含量能够良好反映细胞的增殖情况[13]。本实验结果显示，龙胆苦苷能够显著增加溃疡性压疮创面骨骼肌组织中PCNA蛋白及mRNA表达，促进肌细胞增殖。

综上所述，养阴生肌散主要是通过龙胆苦苷成分发挥治疗溃疡的作用；龙胆苦苷能够有效缩短溃疡性压疮创面愈合时间并提高愈合率，促进创面细胞的增殖及新生组织的形成，减少炎性细胞，其机制可能与龙胆苦苷可上调溃疡性压疮创面组织细胞中PCNA的表达相关。本实验既为龙胆苦苷单体药物治疗溃疡性压疮提供了理论和实验支持，也为临床剂型改进提供了理论参考。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。