滇龙胆优质种质筛选及离体培养条件优选研究

赵志莲等

摘要：以大理州不同居群滇龙胆（Gentiana rigescens Franch.ex Hemsl.）、同一居群不同植株为试验材料，采用高效液相色谱法（HPLC）对滇龙胆根及根茎中龙胆苦苷的含量进行测定；再以龙胆苦苷含量≥7.0 %的优质种质资源为外植体，采用正交试验设计方法研究培养基、蔗糖浓度、pH及培养温度对滇龙胆离体培养植株再生的影响。结果表明，大理州6个居群滇龙胆根及根茎中的龙胆苦苷含量较高，不同居群间龙胆苦苷含量具有显著差异（P<0.05），以鹤庆县居群的龙胆苦苷含量最高（80.70 mg/g），含量最低的巍山县居群也超过国家药典规定标准的2倍多；同一居群内不同植株滇龙胆根及根茎中龙胆苦苷含量差异较小，只有云龙县居群不同植株间具有显著差异（P<0.05），其他居群不同植株间无显著差异（P>0.05）；滇龙胆生长点离体培养及植株再生最适培养基和培养条件是1/2MS+30 g/L蔗糖+pH 5.2+20 ℃/25 ℃变温培养，再生植株诱导率最高可达88.9%，试验初步建立了滇龙胆离体培养及植株再生体系。

关键词：滇龙胆（Gentiana rigescens Franch.ex Hemsl.）；种质资源；龙胆苦苷；离体培养；植株再生

中图分类号：S567.23+9；S502.4；Q946.83 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）17-4228-04

滇龙胆（Gentiana rigescens Franch.ex Hemsl.）是龙胆科（Gentianaceae）龙胆属[Gentiana（Tourn.）L.]多年生草本植物，别名坚龙胆、龙胆草、兰花根、青鱼胆等，主要分布在云南、贵州、四川等省[1]，为国家重点保护三级野生药材濒危物种。滇龙胆是传统中药龙胆的重要基源植物，以根及根茎入药，具有清热泻火、保肝健脾、消炎杀菌等作用[2]。最新药理学研究表明，滇龙胆还具有抗呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytial Virus，RSV）、降血糖等功效[3，4]。

研究[5-7]发现，滇龙胆根及根茎中主要活性成分龙胆苦苷的含量因产地不同而存在较大的差异，云南省不同产地的滇龙胆其根及根茎中龙胆苦苷的含量在2.75%～4.87%，全省滇龙胆的龙胆苦苷含量平均为4.77%；其中大理白族自治州的洱源、巍山、剑川县所产滇龙胆根及根茎中龙胆苦苷的含量分别为7.02%、6.02%、5.35%，显著高于寻甸县所产滇龙胆的龙胆苦苷含量（3.85%）以及昆明市所产滇龙胆的龙胆苦苷含量（2.45%）。由此可见，大理州所产滇龙胆根及根茎中的龙胆苦苷含量远远高于《中国药典》中1.5%[8]的限量标准，所以有必要以根及根茎中龙胆苦苷含量为标准对大理州滇龙胆优质种质资源进行筛选，并建立滇龙胆优质种质资源离体培养及植株再生体系。为此，试验采用高效液相色谱法（High performance liquid chromatography，HPLC）对大理州范围内所产滇龙胆野生优质种质资源进行筛选，再以活性成分龙胆苦苷含量较高的野生优质种质资源为外植体，在植物组织培养基中不添加任何植物激素的条件下，采用正交试验设计方法研究培养基、蔗糖浓度、pH及培养温度对滇龙胆离体培养及植株再生的影响，以期为滇龙胆野生优质种质资源筛选、离体保存、快速繁殖、资源可持续利用提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 采样点选择与样品采集 2011年9～11月，分别在云南省大理州的大理市、剑川县、鹤庆县、巍山彝族回族自治县、云龙县、洱源县等滇龙胆的主要原料来源地采集野生居群单株，各居群间距离100 km，株距不小于3 m，6个居群各随机采集30株，自然干燥。滇龙胆离体培养及植株再生外植体为大理市居群12～2月分化的休眠芽生长点。

1.1.2 仪器与试剂 仪器主要有美国惠普公司Agilent1100高效液相色谱仪（包括G1313A ALS自动进样器、G1315A/B DAD 检测器、Agilent ChemStation色谱工作站）、梅特勒-托利多AE240分析天平[瑞士梅特勒-托利多仪器（中国）有限公司]、SK5200H型超声波清洗仪（上海科导超声仪器有限公司）、FY135型中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）、Millipore纯水处理系统[默克化工技术（上海）有限公司]、BUCHI旋转蒸发仪（瑞士步琦有限公司）以及人工智能气候箱；高压灭菌器；无菌操作台等。试剂主要有中国药品生物制品检定所提供的龙胆苦苷对照品（批号：110770-200510），高效液相用甲醇为色谱纯，高效液相用水为三重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

1.1.3 样品的选择 在滇龙胆不同居群根及根茎中龙胆苦苷含量测定时，从每个居群中随机选取根及根茎质量为6.0～6.6 g的植株9株混合后作为样品。在滇龙胆同一居群不同植株根及根茎中龙胆苦苷含量测定时，以龙胆苦苷含量较高的4个居群为研究对象，从每个居群中随机选取根及根茎质量为6.0～6.6 g的植株5株作为样品。

1.2 方法

1.2.1 样品中龙胆苦苷含量测定 所有样品经过粉碎、过100目筛、混合均匀，按照前期建立的方法[9]提取与测定龙胆苦苷的含量，每个样品重复测定3次。龙胆苦苷含量用龙胆苦苷质量/干物质质量表示。

1.2.2 滇龙胆离体培养及植株再生 滇龙胆外植体处理及接种方法按照前期建立的方法[9]完成。采用L9（34）正交试验方法设计因子水平，分别设培养基、蔗糖浓度、pH和培养温度4个因子，每个因子取3个水平，基本培养基为MS（含琼脂8 g/L），各因子水平组合见表1。培养容器为250 mL玻璃三角瓶，每瓶加入50 mL培养基，120 ℃高压灭菌15 min，冷却后每瓶接种6个外植体，每个处理接种5瓶，设3次重复。培养温度按试验设计进行设置，光照度为27 μmol/（m2·s），光照时间为16 h/d。培养30 d后统计出芽数（接种外植体中有芽生成的外植体数），计算诱导率，诱导率为出芽数占接种外植体数的百分数。

1.3 数据处理

试验所得数据表述为“平均数±标准差”，应用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 结果与分析

2.1 滇龙胆居群间及居群内植株根及根茎中龙胆苦苷含量比较

2.1.1 不同居群的根及根茎中龙胆苦苷含量 试验测定得到的龙胆苦苷对照品及试验样品的色谱图见图1，不同居群的根及根茎中龙胆苦苷含量情况见表2。在对大理州6个不同居群滇龙胆根及根茎中龙胆苦苷含量的比较分析后发现，大理州所产滇龙胆根及根茎中的龙胆苦苷含量整体较高，均高于《中国药典》中1.5%[8]的限量标准。其中，含量较低的巍山县居群和剑川县居群就分别达到了42.87、57.33 mg/g，而鹤庆县居群滇龙胆根及根茎中的龙胆苦苷含量高达80.70 mg/g，显著高于其他5个居群（P<0.05）；大理市、云龙县、洱源县3个居群之间滇龙胆根及根茎中的龙胆苦苷含量（分别为73.30、72.27、72.40 mg/g）差异不显著（P>0.05），但也显著高于巍山县居群和剑川县居群（P<0.05）。研究结果表明，大理州的6个野生滇龙胆居群之间根及根茎中龙胆苦苷含量具有差异分化，在野生滇龙胆中存在龙胆苦苷含量较高的优质种质资源，这为从野生滇龙胆居群中筛选根及根茎中龙胆苦苷含量较高的优质种质资源提供了依据。

2.1.2 同一居群不同植株的根及根茎中龙胆苦苷含量 大理州野生滇龙胆在大理市、洱源县、鹤庆县、云龙县4个居群内不同植株的根及根茎中龙胆苦苷含量测定结果见表3。对表3数据比较分析可知，大理市、洱源县、鹤庆县3个居群内植株之间的滇龙胆根及根茎中龙胆苦苷含量差异不显著（P>0.05），仅云龙县居群的植株间龙胆苦苷含量存在显著差异（P<0.05），说明滇龙胆同一居群内各植株的根及根茎中龙胆苦苷含量具有较稳定的居群遗传能力，可以把从野生滇龙胆居群中筛选出的根及根茎中龙胆苦苷含量较高的优势居群作为繁殖及育种材料使用。

2.2 滇龙胆离体培养及植株再生的结果

2.2.1 L9（34）正交试验设计因素对滇龙胆离体培养及植株再生的影响 试验设计的L9（34）正交试验结果见表4。从表4可见，当试验因素水平组合为MS培养基+蔗糖20 g/L+pH 5.2+培养温度20 ℃/25 ℃时，滇龙胆离体培养接种外植体芽的诱导率最高，达到了84.4%。对滇龙胆离体培养芽诱导率进行L9（34）正交试验结果分析可知，培养温度和培养基pH是滇龙胆离体培养诱导芽的主要影响因素，对滇龙胆离体培养芽诱导率的影响较大，而培养基类别和蔗糖浓度对滇龙胆离体培养芽诱导率的影响较小。综合各因子分析结果，得出滇龙胆离体培养及植株再生的最佳组合是A2B3C1D3，即培养基类别为 1/2 MS培养基+蔗糖30 g/L+ pH 5.2+培养温度20 ℃/25 ℃；用此组合方法对滇龙胆离体培养芽诱导进行了验证试验，结果芽诱导率达到了88.9%，与试验结果相近，证明L9（34）正交试验所得结果具备客观有效性，可以作为滇龙胆离体培养芽诱导的培养方法。

2.2.2 方差分析 为了进一步了解试验设计的各因子之间在滇龙胆离体培养促进效果方面的差异，又对试验结果芽诱导率进行了方差分析，结果见表5。由表5可知，因子D（培养温度）对滇龙胆离体培养芽诱导率产生的作用达到了极显著差异水平（P<0.01），因子C（pH）对滇龙胆离体培养芽诱导率的作用达到了显著差异水平（P<0.05），而因子A（培养基种类）和因子B（蔗糖浓度）对滇龙胆离体培养芽诱导的作用不显著（P>0.05）。综合各因子的表现，得出滇龙胆离体培养及植株再生的最佳组合是A2B3C1D3，即培养基种类为1/2MS+蔗糖浓度30 g/L+pH 5.2+培养温度20 ℃/25 ℃。

3 讨论

试验结果表明，大理州范围内滇龙胆根及根茎中龙胆苦苷含量整体较高，滇龙胆不同居群间龙胆苦苷含量具有显著差异（P<0.05），其中，鹤庆县居群龙胆苦苷含量显著高于其他居群，含量最低的巍山县居群中龙胆苦苷含量也是《中国药典》2010年版1.5%[8]限量标准的2倍多。滇龙胆同一居群不同植株根及根茎中龙胆苦苷含量差异较小，大理市、洱源县、鹤庆县3个居群内不同植株间龙胆苦苷含量差异不显著（P>0.05），云龙县居群内不同植株间龙胆苦苷含量具有显著差异（P<0.05），说明滇龙胆同一居群内不同植株根及根茎中龙胆苦苷含量具有较稳定的居群遗传能力，这个研究结果与杨维泽等[10]的研究结果相似，滇龙胆居群间表型变异高于居群内的表型变异。证明大理州范围内存在龙胆苦苷含量较高的野生滇龙胆优质种质资源，野生滇龙胆居群间龙胆苦苷含量差异较大，居群内龙胆苦苷含量差异较小。

植物组织培养技术是开展珍稀濒危药用植物资源保护、离体培养及植株再生研究的有效途径。试验结果表明，在培养基中不添加任何植物激素的条件下，不同组合的培养基、蔗糖浓度、pH及培养温度处理均能诱导滇龙胆茎尖生长点再生植株，优选出滇龙胆离体培养及植株再生的最佳培养组合条件是培养基种类为1/2MS+蔗糖浓度30 g/L+pH 5.2+培养温度20 ℃/25 ℃。而朱宏涛等[11]、罗春梅等[12]及张洁等[13]的研究都在培养基中添加了植物生长调节剂，滇龙胆外植体经过愈伤组织途径后再完成植株再生，与本研究的植株再生方式不一样。因此，滇龙胆离体培养再生植株根及根茎中龙胆苦苷含量较高的性状是否能够得到稳定遗传？同时本研究仅建立了大理州滇龙胆居群离体培养及植株再生体系，在此培养基及培养条件下是否能建立其他居群的离体培养及植株再生体系等，都还需要经过下一步的试验研究来证实。

参考文献：

[1] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志（第62卷）[M].北京：科学出版社，1988.100-101.

[2] 庄绪会，孙 娇，张庆芝.昆明龙胆与滇龙胆中龙胆苦苷含量的比较[J].云南中医学院学报，2010，33（1）：12-13，23.

[3] GAO L J， XIANG L，LUO Y， et al. Gentisides C-K： Nine new neuritogenic compounds from the traditionaL Chinese medicine Gentiana rigescens Franch[J]. Bio & Med Chemi，2010， 18： 6995-7000.

[4] ANONYMOUS. Natural product research； Research on natural product research discussed by scientists at harbin medical university[J].China Weekly News，2011，8（16）：60-65.

[5] 来国防，程 宾，罗士德，等.云南不同产地滇龙胆中龙胆苦苷的含量测定[J].时珍国医国药，2010，21（8）：1867-1868.

[6] 李智敏，赵 磊，白艳婷，等.不同产地滇龙胆中龙胆苦苷的含量测定[J].云南中医学院学报，2008，6（12）：10-11，14.

[7] 李智敏，刘 莉，李晚谊，等.滇龙胆的药用资源研究与开发进展[J].云南大学学报（自然科学版），2009，31（S1）：485-487.

[8] 中华人民共和国国家药典编纂委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：化学工业出版社，2010.89.

[9] 赵志莲，李海峰，张德全，等.滇龙胆种质资源筛选及离体培养的初步研究[J].北方园艺，2013（8）：168-172.

[10] 杨维泽，金 航，杨美权，等.云南滇龙胆居群表型多样性及其与环境关系研究[J].西北植物学报，2011，31（7）：1886-1890.

[11] 朱宏涛，陈可可，张颖君，等.坚龙胆的快速繁殖[J].天然产物研究与开发，2004，11（3）：25-27.

[12] 罗春梅，邱 璐，刘爱民.不同激素组合对诱导滇龙胆顶芽及腋芽产生不定芽的研究[J].楚雄师范学院学报，2005，20（3）：49-52.

[13] 张 洁，刘红美.贵州产坚龙胆组织培养体系的建立[J].湖北农业科学，2013，52（17）：4250-4252.