A型肉毒毒素在前列腺疾病中的作用及机制研究进展

胡平，陈平

(同济大学生命科学与技术学院，上海 200092)

自1989年美国食品药品管理局批准注射用A型肉毒毒素(botulinum toxin type A，BoNT/A)上市以来[1]，其应用不断拓展，目前已广泛应用于临床治疗，且在神经系统疾病(肌张力障碍、痉挛、疼痛、自主神经功能障碍等)[2]、美容[3]、泌尿系统疾病[4]、癌症引起的局部疼痛以及癌症手术放疗部位疼痛的缓解[5]、抑郁症[6]等中具有重要作用。近年来，BoNT/A在治疗泌尿系统疾病方面的应用越来越多，主要包括膀胱括约肌协同失调以及神经性逼尿肌过度活动引起的尿失禁，尤其对具有神经源性膀胱过度活跃症状患者的疗效较好[7]。临床上，BoNT/A常被用于治疗良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia，BPH)、前列腺炎等。BPH发生时，间质细胞增生、平滑肌细胞变得粗大且密集，上皮细胞增生主要表现为基底细胞的增生、肥大细胞由正常扁平变为立方或矮柱状[8]。BPH是造成中老年排尿障碍的一个重要原因，腺体增大会导致膀胱出口梗阻和下尿路症状等。而注射BoNT/A已成为临床治疗BPH患者的一种重要治疗手段。目前治疗前列腺炎的药物主要包括抗菌药物、抗炎药物等，但均很难使患者痊愈。前列腺炎分为Ⅰ～Ⅳ型，其中Ⅲ型前列腺炎为慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征，BoNT/A对慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征治疗效果较好[9]。现就BoNT/A在前列腺疾病中的作用及机制研究进展予以综述。

1 肉毒毒素简介

1.1肉毒毒素结构 肉毒毒素是由肉毒梭菌产生的一种神经毒素蛋白，由肉毒神经毒素和辅助蛋白组成；其分子量为150 000，由分子量为50 000的轻链和100 000的重链通过二硫键连接组成[10]。自然产生的肉毒毒素有7种，根据抗原性不同分为A、B、C、D、E、F和G型，其中BoNT/A应用最多且毒性最强、作用时间最久。BoNT/A分子复合体的分子量为900 000，由分子量为150 000的神经毒素和750 000的辅助蛋白组成，包含19种氨基酸[11]。

1.2BoNT/A作用机制 BoNT/A作用机制主要为BoNT/A轻链的内切酶切割作为可溶性N-乙基顺丁烯二酰亚胺敏感性的融合蛋白附着蛋白受体复合体之一的突触相关蛋白-25(synaptosomal-associated protein of 25 kDa，SNAP-25)，从而抑制突触小泡与前膜融合，阻断乙酰胆碱的释放[12]。其作用过程主要分为：①BoNT/A重链与低亲和力受体三涎酸神经节苷脂结合，聚集细胞膜上的高亲和力受体SV2(synaptic vesicle glycoprotein 2)，BoNT/A通过与低亲和力及高亲和力受体结合实现BoNT/A在细胞膜上聚集并形成胞内体进入胞质内；②BoNT/A轻链在胞内体的酸性环境中被切割成具有内切酶活性的肽段；③在ATP酶供能下，BoNT/A重链易位区插入胞内体的脂质双分子层上形成细小通道供轻链释放至胞质；④轻链的内切酶活性肽段可以水解位于靶膜上的SNAP-25，在SNAP-25 C端移除9个氨基酸残基，导致可溶性N-乙基顺丁烯二酰亚胺敏感性的融合蛋白附着蛋白受体复合体形成受阻，无法为膜融合提供能量，进而影响突触小体与突触前膜的融合，导致乙酰胆碱等神经递质无法释放，信号转导受阻[13]。除乙酰胆碱外，BoNT/A还可抑制突触前膜释放的去甲肾上腺素、降钙素相关肽、P物质和谷氨酸等[14]。

前列腺组织具有丰富的交感神经和副交感神经，BoNT/A能够作用于前列腺组织的原因为其可封闭局部交感神经末梢分泌的肾上腺素和副交感神经末梢分泌的乙酰胆碱。前列腺上皮细胞的过度增殖及平滑肌收缩均会导致前列腺疾病的发生，其中前列腺上皮细胞的生长受副交感神经调控，激活胆碱能受体可促进前列腺上皮细胞生长和分泌，而交感去肾上腺素能神经主要负责调控前列腺平滑肌收缩[15]。可见，应用BoNT/A治疗前列腺疾病主要是通过其阻断神经的传导。另外，BoNT/A还可促进前列腺细胞凋亡，但具体机制目前尚不明确。

2 BoNT/A在BPH中的应用

临床上通过注射BoNT/A治疗BPH，具有疗效显著、安全且耐受良好的特点。与应用尿道前列腺电切术治疗相比，前列腺内注射BoNT/A治疗可减小BPH患者前列腺体积、降低血清总前列腺特异性抗原(prostate specific antigen，PSA)水平和残余尿量[16]。与传统药物相比，BoNT/A具有更好的疗效。如临床治疗发现，与抗胆碱能药物相比，BPH患者膀胱逼尿肌注射BoNT/A疗效更显著[17]。关于BoNT/A治疗BPH伴排尿功能障碍的Ⅲ期临床试验表明，注射BoNT/A后患者尿道阻力显著改善，其疗效优于安慰剂治疗[4]。

2.1诱导前列腺癌细胞凋亡 一项临床研究发现，13例BPH患者在注射200 U BoNT/A 2个月后症状改善，且症状评分、血清PSA水平均降低，而3例注射0.9%氯化钠注射液的BPH患者症状评分和血清PSA水平均无显著变化[18]。在超声引导下，给予32例BPH患者注射200 U BoNT/A，结果发现，治疗1个月后，临床症状及残余尿量、PSA水平、前列腺体积均显著改善，且在治疗后6个月达到最佳水平，BoNT/A的症状改善作用持续了至少1年[19]。对于药物治疗失败、不适合或拒绝手术的45例BPH患者，经直肠超声法注射100 U BoNT/A至患者前列腺基底区和中段过渡区，结果显示国际前列腺症状量表评分降低，排尿后残余尿量减少，前列腺体积显著减小，下尿路症状显著改善[20]。在超声引导会阴注射BoNT/A的77例BPH患者中，治疗1个月后，41例患者主观症状缓解；治疗2个月后，55例患者主观症状缓解；且与基线相比，患者美国泌尿外科学会评分、血清PSA水平、残余尿量降低，前列腺体积减小，平均峰值尿流率升高[21]。

BoNT/A可通过促进前列腺组织细胞凋亡减小前列腺体积。在前列腺增生模型大鼠的前列腺注射BoNT/A，前列腺的实际重量降低32.5%，回归到正常前列腺重量水平[22]。有实验证明，前列腺增生大鼠前列腺重量减少是注射BoNT/A诱导前列腺组织细胞凋亡的结果，且随着注射剂量的增加，前列腺腺体的重量不断降低；同时，注射BoNT/A的前列腺增生大鼠B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)基因表达下调，细胞表面死亡受体Fas和胱天蛋白酶(caspase)3表达上调[23]。在细胞凋亡过程中，Bcl-2家族成员和Fas/Fas配体信号通路起重要作用，而caspase-3是哺乳动物细胞凋亡通路的关键死亡蛋白酶。在大鼠前列腺内注射BoNT/A后发现，前列腺上皮细胞Bcl-2样蛋白1表达下调，caspase-3和Bcl-2相关X蛋白表达上调[24]。Bcl-2相关X蛋白属于Bcl-2基因家族，具有促进细胞凋亡的功能。但BoNT/A诱导前列腺细胞凋亡的具体机制目前尚不明确。

2.2抑制前列腺组织血管形成 BoNT/A还可抑制前列腺组织血管形成。前列腺增生组织的血管增生多分布于内腺以及增生结节的内部和周边的前列腺间质。在大鼠前列腺内注射BoNT/A可通过抑制缺氧诱导因子-1α和血管内皮生长因子的表达，抑制前列腺组织的血管形成，促使前列腺体积缩小[25]。研究发现，前列腺癌获得的放疗抵抗特性与缺氧诱导因子-1α具有的细胞修复和细胞增殖能力有关[26]。

2.3调控生长因子 BoNT/A对生长因子具有调控作用。转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)主要聚集在前列腺基质，其对前列腺上皮细胞具有负调控作用，TGF-β1水平升高可抑制细胞增殖，而水平降低可促进细胞增殖[27]。在其他生长因子存在时，TGF-β1不会导致细胞凋亡，但可使细胞生长增殖停止[28]。碱性成纤维细胞生长因子可以浓度依赖的方式促进增生前列腺间质细胞增殖，并抑制平滑肌细胞增殖，故TGF-β1/碱性成纤维细胞生长因子比例失调是前列腺增生的重要发病机制[29]。在Wistar大鼠增生的前列腺组织中注射BoNT/A后，TGF-β1的表达上调，碱性成纤维细胞生长因子的表达下调，前列腺组织细胞凋亡增加[30]。与正常组织相比，增生前列腺组织中的成纤维细胞生长因子水平显著升高，而成纤维细胞生长因子可促进上皮细胞和间质细胞生长[31]。另有研究发现，BoNT/A可抑制成纤维细胞增殖，同时还可促进其凋亡，从而减弱成纤维细胞生长因子对前列腺组织的增生作用[32]。而BoNT/A对成纤维细胞生长因子的抑制作用可能与c-Jun氨基端激酶磷酸化水平升高有关[33]。

3 BoNT/A在前列腺炎中的应用

前列腺炎是一种常见的前列腺疾病，主要症状为尿道刺激症状和慢性盆腔疼痛。前列腺炎分为4型：Ⅰ型前列腺炎为急性细菌性前列腺炎，Ⅱ型前列腺炎为慢性细菌性前列腺炎，Ⅲ型前列腺炎为慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征，Ⅳ型前列腺炎为无症状性前列腺炎。BoNT/A对慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征具有较好的疗效。

3.1抑制前列腺平滑肌收缩 部分前列腺炎患者抗菌、抗炎药物治疗效果不佳。临床上已将α受体阻滞剂用于前列腺炎的治疗，通过松弛前列腺等部位的平滑肌缓解前列腺内尿液反流，减轻炎症症状。Maria等[34]首次应用BoNT/A注射治疗慢性前列腺炎发现，BoNT/A的作用主要为抑制前列腺平滑肌收缩。在犬前列腺注射200 U BoNT/A后，其前列腺基质组织平滑肌收缩水平显著降低，同时不影响前列腺的松弛反应[35]。

3.2抑制神经肽释放 Wang等[36]建立Wistar大鼠慢性单关节炎模型，经BoNT/A治疗后发现，大鼠软骨退变和炎症细胞浸润均减轻，提示BoNT/A在抗神经性炎症治疗中发挥重要作用，其原因可能为注射BoNT/A可抑制伤害性神经肽的释放，从而起镇痛作用。一项双盲研究将60例慢性前列腺炎患者随机分为BoNT/A治疗组和安慰剂组，结果发现，与安慰剂组相比，BoNT/A治疗组患者的排尿障碍显著改善，且治疗后的1、3、6个月，疼痛亚量表评分较基线分别降低64.76%、75.63%和79.97%，视觉模拟评分分别降低62.3%、72.4%和82.1%，同时慢性前列腺炎症状评分、美国泌尿外科学会评分、昼尿频率、夜尿频率均较基线值显著降低[9]。另一项无对照、随机试验比较了63例慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征男性患者经尿道和经直肠超声引导下注射BoNT/A的疗效，结果显示，治疗6个月后，患者的最大尿流量均显著改善，其中28例经尿道注射BoNT/A的患者生活质量和疼痛均有所改善，35例经直肠超声引导下注射BoNT/A的患者慢性前列腺炎症状指数显著降低，但疼痛改善不明显[37]。有学者对13例慢性盆腔疼痛综合征患者进行会阴注射BoNT/A治疗，结果显示均未出现不良反应和并发症，且缓解疼痛效果显著[38]。对于成年男性Ⅲ型非细菌型慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征患者给予BoNT/A治疗后，前列腺疼痛显著减轻，且BoNT/A可有效阻断疼痛感受在盆底功能障碍中的传导9～12个月[39]。BoNT/A在改善前列腺炎患者疼痛方面效果显著，同时对于炎症的缓解也至关重要。

3.3调控环加氧酶2(cyclo-oxygenase-2，COX-2)的表达 有学者通过注射辣椒素建立非细菌型前列腺炎大鼠模型发现，其COX-2水平升高，而注射BoNT/A的大鼠COX-2水平显著降低；BoNT/A预处理可减少辣椒素引起的疼痛行为和炎症反应，且呈剂量依赖性，注射BoNT/A可有效改善大鼠的前列腺炎症状[40]。COX-2与许多涉及组织炎症和疼痛的病理生理过程有关，并可诱导前列腺素合成，尤其是前列腺素E2的合成[41]。有实验证明，BoNT/A可显著降低小鼠的前列腺素E2水平[42]。一项关于大鼠关节炎疼痛的实验发现，BoNT/A可抑制重要炎症介质(肿瘤坏死因子-α)的释放，通过调节小胶质细胞介导的神经炎症而减轻疼痛[43]。但BoNT/A是否直接调控COX-2的表达以及是否参与调控其他炎症分子的表达均还需进一步研究。

4 BoNT/A在前列腺癌中的应用

4.1抑制其他癌细胞的作用 BoNT/A能够抑制癌细胞的生长，包括乳腺癌细胞、胃癌细胞等。实验发现，与正常乳腺细胞MCF10A相比，BoNT/A对乳腺癌细胞的细胞毒性更强，其可诱导T47D乳腺癌细胞系caspase-3和caspase-7依赖性死亡[44]。另有研究发现，在胃的迷走神经注射BoNT/A可显著降低肿瘤的发生率和延缓肿瘤进展。体外实验发现，BoNT/A对胃癌细胞BGC-823和MGC-803增殖均有抑制作用，且增加剂量和作用时间其抑制作用更显著[45]。

4.2促进前列腺癌细胞凋亡 在原位前列腺肿瘤的瘤体内注射BoNT/A后，肿瘤体积缩小，但这种效果维持不超过8个月，且仅局限于晚期前列腺癌[46]，可能与BoNT/A对前列腺癌细胞的表观遗传修饰有关。另外，BoNT/A可在一定程度上促进前列腺癌细胞凋亡。体内和体外试验均发现，BoNT/A可降低人前列腺癌细胞系LNCaP的增殖并促进其凋亡，但对激素非依赖性前列腺癌细胞系PC-3则无显著影响；LNCaP细胞和PC-3细胞均表达BoNT/A的蛋白受体SV2，但LNCaP中的SV2数量约为PC-3的4倍，可能与BoNT/A进入细胞的量有关[47]。研究发现，在BoNT/A处理后96 h，LNCaP细胞生长减少了20%，PC-3细胞生长减少了25%，且在LNCaP和PC-3细胞中检测到SV2，提示BoNT/A可能通过SV2受体进入前列腺癌细胞，因此SV2作为BoNT/A受体可能成为一个抗肿瘤靶点；另外，BoNT/A诱导的细胞溶质型磷脂酶A2亚型磷脂酶A2-α磷酸化形式的增加可能是抑制前列腺癌细胞生长的一种机制[48]。BoNT/A对前列腺癌细胞增殖具有抑制作用，随着药物浓度的增加，前列腺癌细胞DU145在划痕实验中的迁移能力明显受到抑制，经BoNT/A处理后DU145中的p53表达水平显著升高[49]，因此BoNT/A可能是潜在的抗癌候选药物。

4.3神经支配 神经支配是前列腺癌发生、发展的关键因素，双侧去神经支配可降低小鼠肿瘤的发生率和减小肿瘤体积；在人前列腺单侧注射BoNT/A后，癌细胞凋亡显著增加[50]。人的前列腺受自主神经系统支配，M受体定位于前列腺，M3受体可促进前列腺癌细胞的增殖[51]。经BoNT/A处理后，乙酰胆碱受体M3的转录水平降低[52]，提示BoNT/A可能通过去神经作用控制前列腺癌的进展。

5 小 结

注射BoNT/A治疗前列腺疾病(BPH、前列腺炎等)具有一定的临床疗效。且对于无法手术、不能忍受长期服药或经手术药物疗法症状无显著改善的患者，注射BoNT/A治疗是一个很好的选择。BoNT/A可通过促进前列腺增生组织细胞凋亡、抑制神经递质的释放及镇痛而发挥作用。但BoNT/A对于前列腺疾病甚至泌尿外科疾病是否具有更显著的疗效，还需进行更多的临床探索，包括利用分子生物学技术进行多种肉毒毒素蛋白的融合和突变等。未来继续深入研究BoNT/A治疗前列腺疾病的机制不仅可优化前列腺疾病的治疗，为前列腺癌治疗提供新思路和方法，还可扩大临床应用范围，拓展更多的新型治疗药物。