血浆和腹膜透析液中万古霉素浓度的测定及在腹膜透析相关性腹膜炎患者中的应用

方 玲，吴依繁，程光敏，徐星铭，赵 珉，夏 泉*

(1.安徽医科大学第一附属医院药剂科，合肥 230022；2.国家中医药管理局中药化学三级实验室，合肥 230022；3.安徽中医药大学药学院，合肥 230012； 4.安徽医科大学第一附属医院肾脏内科，合肥 230022)

腹膜透析是终末期肾脏病一种有效的替代疗法，而各种感染导致的腹膜透析相关性腹膜炎是其常见的并发症，也是患者终止腹膜透析治疗的主要原因[1]，腹膜炎治疗推荐万古霉素和第三代头孢菌素联合腹腔给药[2-3]。万古霉素的治疗效果与其在体液中的谷浓度密切相关，而肾功能不全患者个体间的药物谷浓度差异较大[4]。但由于残余肾功能的影响，腹腔应用万古霉素后，不同患者的药物排泄速率有明显差异，因此需监测血浆和腹膜透析液中万古霉素的浓度，并根据监测结果调整药物剂量。本研究建立了高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)法同时测定血浆和腹膜透析液中万古霉素的浓度，并应用于腹膜透析相关性腹膜炎患者的样品测定，以期为临床个体化用药提供参考。

1 仪器和试药

1.1 仪器 安捷伦1260液相色谱分析仪(美国安捷伦公司)；KDC-1044低速离心机、HC-3018R高速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；超声波清洗机(赛飞中国有限公司)；SHB-Ⅲ循环水真空泵(郑州长城科工贸公司)；FA2004电子天平(精度十万分之一，德国Mettler Toledo公司)；涡旋仪(上海沪西分析仪器厂有限公司)。

1.2 药品和试剂 万古霉素对照品(纯度98%，批号130360-201302)和去甲万古霉素对照品(纯度87.7%，批号130338-201704)由中国食品药品检定研究院提供；磷酸二氢钾(KH2PO4，分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；乙腈、甲醇(色谱纯，瑞典欧普森色谱试剂公司)；高氯酸(分析纯，上海润捷化学试剂有限公司)；磷酸(分析纯，上海苏懿化学试剂有限公司)。

2 方 法

2.1 对照品溶液和内标溶液的配制 (1)对照品溶液：精密称取万古霉素对照品10.00 mg，置10 ml容量瓶中，用超纯水溶解并稀释至刻度，配制成1.00 mg/ml的对照品储备液。精密量取对照品储备液10、20、50、100、200、400、600、800、1000、2000 μl，置于5 ml容量瓶中，用超纯水定容，配制成浓度为2、4、10、20、40、80、120、160、200、400 μg/ml的万古霉素对照品溶液。(2)内标溶液：精密称取去甲万古霉素对照品5.00 mg，置20 ml量瓶中，用超纯水稀释并定容，配制成浓度为0.25 mg/ml的内标溶液A，精密量取600 μl内标溶液A，置于5 ml容量瓶中，用超纯水稀释成浓度为0.12 mg/ml的内标溶液B。

2.2 血浆样品和腹膜透析液样品的预处理 采集静脉血和腹膜透析液样品各3 ml，置EDTA抗凝管中，以相对离心力1.861×103×g离心10 min，分别精密吸取血浆和腹膜透析液各200 μl，置于1.5 ml离心管中，血浆样品加内标溶液A，腹膜透析液样品加内标溶液B，加入200 μl的10%高氯酸∶乙腈(6∶1)，涡旋混匀，以相对离心力1.2×104×g离心10 min，分别取10 μl上清液进样分析。

2.3 色谱条件 色谱柱为Waters Symmetry C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇∶乙腈∶0.05 mol/L KH2PO4(11∶2∶87)；检测波长236 nm；流速1.0 ml/min；柱温30 ℃；进样量10 μl。

2.4 专属性实验 分别取空白样品、空白样品+去甲万古霉素内标溶液A、空白样品+万古霉素对照品溶液、血浆样品+去甲万古霉素内标溶液A、腹膜透析液样品+去甲万古霉素内标溶液B，按2.2项下方法做预处理，按2.3项下色谱条件进样分析。

2.5 标准曲线的建立 (1)血浆样品：取7份空白血浆160 μl，加入20 μl内标溶液A，分别加入浓度为2、4、20、40、120、200、400 μg/ml的万古霉素对照品溶液20 μl，配制成系列浓度为0.2、0.4、2、4、12、20、40 μg/ml的血浆样品，预处理后进样分析。(2)腹膜透析液样品：取7份空白腹膜透析液160 μl，加入20 μl的内标溶液B，分别加入浓度为2、4、10、20、40、80、160 μg/ml的万古霉素对照品溶液20 μl，配制成系列浓度为0.2、0.4、1、2、4、8、16 μg/ml的腹膜透析液样品，预处理后进样分析。

2.6 精密度实验 精密吸取万古霉素对照品溶液和内标溶液，加入空白血浆或空白腹膜透析液配制成4种浓度的万古霉素混合样品，包括定量限、低浓度、中浓度、高浓度，具体如下。(1)血浆样品：万古霉素浓度为0.2、0.4、20、32 μg/ml，去甲万古霉素为25 μg/ml；(2)腹膜透析液样品：万古霉素浓度为0.2、0.4、8、12 μg/ml，去甲万古霉素为12 μg/ml。预处理后进样分析，计算日内精密度。每个浓度平行配制5份，连续测定3 d，计算日间精密度。

2.7 回收率实验 采用2.6项下方法分别配制4种浓度的万古霉素血浆和腹膜透析液样品，预处理后进样分析，得到万古霉素峰面积，同时将对照品和内标溶液加适量水稀释后，配置成万古霉素和去甲万古霉素终浓度与上述血浆和腹膜透析液浓度一致的水溶液样品，进样分析，得到万古霉素峰面积，计算提取回收率和方法回收率。提取回收率=(血浆或腹膜透析液样品万古霉素峰面积/水溶液样品万古霉素峰面积)×100%，方法回收率=(实测浓度/标示浓度)×100%。

2.8 稳定性实验 配制低、中、高浓度的万古霉素样品，各浓度平行12份，分为4组：即刻预处理、室温放置6 h、4 ℃保存24 h、-20 ℃反复冻融3次，每组各3份，预处理后进样分析。

2.9 病例收集和处理 体液样本由安徽医科大学第一附属医院肾内科腹膜透析患者提供，其中空白血浆和腹膜透析液来自未使用万古霉素的患者，含药血浆和腹膜透析液来自腹腔应用万古霉素的患者。本研究经安徽医科大学第一附属医院伦理委员会批准，所有患者均签订书面知情同意书。收集诊断为腹膜透析相关性腹膜炎患者，给予万古霉素2.0 g，每5 d用药1次，腹腔给药并保留6 h；第二次给药前30 min采静脉血和腹膜透析液各3 ml。病例排除标准：(1)入院前已使用过万古霉素者；(2)非腹腔途径给予万古霉素者；(3)主动要求退出试验者。出现以上任一项即排除。

3 结 果

3.1 专属性实验 血浆和腹膜透析液的HPLC谱图见图1和图2。由图1和图2可见，血浆和腹膜透析液中的内源性物质对万古霉素的测定无干扰，内标与待测物分离度良好。

3.2 标准曲线 以万古霉素浓度 (c) 为x轴，万古霉素与去甲万古霉素峰面积的比值为y轴，采用加权(1/x2)最小二乘法线性回归。(1)血浆样品：标准曲线方程为y=0.100 3x+0.303 7(r=0.998 0，n=7)，在0.2～40 μg/ml浓度范围内线性关系良好，定量限为0.2 μg/ml，准确度为(88.53±2.45)%。(2)腹膜透析液样品：标准曲线方程为y=0.278 9x+0.166 8(r=0.999 6，n=7)，在0.2～16 μg/ml浓度范围内呈良好线性关系，定量限为0.2 μg/ml，准确度为(90.21±2.62)%。

图1 血浆样品的HPLC谱图

图2 腹膜透析液样品的HPLC谱图

3.3 回收率实验结果 检测定量限、低浓度、中浓度、高浓度的万古霉素混合样品中万古霉素浓度，计算血浆和腹膜透析液的提取回收率均>85%，方法回收率>85%，结果见表1。

表1 血浆和腹膜透析液中万古霉素的回收率和精密度实验结果

3.4 精密度实验结果 检测定量限、低浓度、中浓度、高浓度的万古霉素混合样品的日内、日间精密度，结果显示低、中、高浓度样品的RSD均<15%，定量限(0.2 μg/ml)的日内、日间RSD<20%。结果见表2。

3.5 稳定性实验结果 血浆和腹膜透析液样品分别在室温放置6 h、4 ℃放置24 h，测定万古霉素稳定性RSD均在1.82%～6.38%范围内，稳定性良好，结果见表2和表3。但低浓度(0.4 μg/ml)万古霉素血浆样品和腹膜透析液样品反复冻融3次，稳定性RSD>15%，血浆样品反复冻融前2次RSD分别为6.52%、12.89%；腹膜透析液样品反复冻融前2次RSD分别为3.90%、12.06%。推荐血浆样品和腹膜透析液样品冻融不超过2次，或在室温放置6 h、4 ℃放置24 h内完成万古霉素浓度测定。

3.6 腹膜炎患者血浆和腹膜透析液中万古霉素浓度的测定 共纳入36例患者，其中男性15例，女性21例；年龄30～61岁，平均年龄(49.42±11.10)岁；透析治疗时长0.1～8.0年，平均治疗时长(3.09±3.03)年；患者的万古霉素血浆浓度10.02～23.43 μg/ml，平均血浆浓度(17.98±2.93) μg/ml；腹膜透析液中万古霉素浓度3.51～15.70 μg/ml，平均浓度(8.15±3.03) μg/ml。有31例患者的万古霉素达到有效治疗浓度(即血浆浓度≥15 μg/ml且腹膜透析液浓度≥4 μg/ml)，另外5例患者的血浆中药物浓度<15 μg/ml或腹膜透析液中药物浓度<4 μg/ml。万古霉素主要经肾脏排泄，腹膜透析患者的肾功能残余量影响药物的浓度，这5例万古霉素浓度不达标的患者尿量均>500 ml/d。之后，根据尿量将患者分为3组：<100 ml/d组、100～500 ml/d组、>500 ml/d组。结果显示，尿量<100 ml/d组患者的血浆和腹膜透析液中药物浓度均达到有效治疗浓度，达标率100%；100～500 ml/d组患者的药物浓度达标率为86.67%，与<100 ml/d组相比，两组患者血浆和腹膜透析液中的药物浓度无显著性差异(P>0.05)。 但尿量>500 ml/d组患者血浆和腹膜透析液中的万古霉素浓度均显著低于前两组(P<0.05)。各组患者血浆和腹膜透析液中万古霉素浓度测定结果见表4。

表2 血浆样品中万古霉素的稳定性实验结果

表3 腹膜透析液中万古霉素的稳定性实验结果

表4 腹膜炎患者血浆和腹膜透析液中万古霉素浓度测定结果

4 讨 论

本研究前期选用甲醇∶乙腈∶0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液(13∶2∶85)作为流动相，万古霉素出峰时间为11.66 min，且与腹膜透析液内源性物质和内标峰分离良好，但血浆中杂质峰与内标峰分离度较差，作者认为这与腹膜透析液、血浆成分差异有关。经腹膜透析治疗交换后的腹膜透析液的成分主要包括水、葡萄糖、蛋白质、钾、肌酐等[5]；而血浆成分较为复杂，包括蛋白质、脂类、无机盐、糖、氨基酸、药物以及药物代谢物。此外，许多腹膜透析患者同时患有多种慢性疾病，服用药物种类繁多，如抗高血压药、降糖药、纠正贫血药物、改善钙磷代谢药物等，这也增加了血浆样品测定的杂质峰。通过多次调整，最终确定流动相比例为甲醇∶乙腈∶0.05 mol/L KH2PO4=11∶2∶87，万古霉素保留时间为17.73～18.63 min，万古霉素、内标与血液或腹膜透析液中内源性成分分离度良好。

关于内标物的选择，曾有文献报道以甲硝唑[6]、替硝唑[7]作为内标，测定生物样品中万古霉素的浓度，但临床常有上述药物联用的情况，这会影响测定结果。去甲万古霉素与万古霉素的结构、活性相似，但毒性较万古霉素大，临床上已较少使用，更不可能将两者合并使用，故本研究选择去甲万古霉素作为内标。

国际腹膜透析协会制订的《腹膜透析相关性腹膜炎指南(2016版)》[3]和《中国万古霉素治疗药物监测指南》均建议，腹膜炎患者的万古霉素血药浓度维持在15 μg/ml以上，但这两个指南均没有明确推荐腹膜透析液中的万古霉素浓度。本院腹膜炎患者腹膜透析液培养G+菌的药敏试验结果显示，万古霉素最低抑菌浓度<4 μg/ml[8]，因此本研究设定腹膜透析液中万古霉素目标浓度为4 μg/ml。腹膜炎患者腹腔给予2.0 g万古霉素，每5 d给药一次，在第2次给药前抽取血液和腹膜透析液测定万古霉素浓度(即谷浓度)，结果发现31例(86.11%)患者的浓度达标，这高于国内其他文献报道的达标率[9]。仅5例患者的血浆药物浓度<15 μg/ml或腹膜透析液中药物浓度<4 μg/ml，可能与该5例患者的尿量较多有关，其中3例患者的尿量>1000 ml/d。根据尿量分组，发现尿量>500 ml/d的患者血浆和腹膜透析液中万古霉素浓度明显低于100～500 ml/d组和<100 ml/d组。因此，有研究者推荐对于有尿的腹透患者，万古霉素的剂量可增加25%[10]，并根据药物浓度监测结果进一步调整剂量。

本研究还存在一些局限性。由于纳入的病例数有限，且腹膜透析液病原菌培养出G+菌的仅17例，因此本研究仅对药物浓度进行分析，并未做疗效评价，课题组后续将扩大临床样本量，进一步分析浓度与疗效的相关性。综上所述，本研究建立的HPLC法可同时测定血浆和腹膜透析液中万古霉素浓度，满足腹膜炎患者的治疗药物监测的需求。本研究检测了36例腹膜炎患者的血浆和腹膜透析液中万古霉素浓度，大部分患者的药物浓度达标，但有尿患者的药物浓度偏低。建议对尿量>500 ml/d的患者适当增加万古霉素剂量，加强浓度监测，以维持有效治疗浓度，提高治疗效果，减少药品不良反应的发生。